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1.醛糖还原酶相似蛋白与肝癌发生相关性的初步研究 2.高尔基碱性神经酰胺酶调控细胞增殖与存活的研究

金俊飞  
【摘要】: 目的:制备、鉴定抗醛糖还原酶相似蛋白(aldose reductase-like protein,ARL-1)多克隆抗体,研究ARL-1在正常人和肝癌患者组织及血清中的蛋白表达水平的差异,探讨ARL-1能否作为一种新的肝癌血清标志物应用于肝癌的早期诊断。 方法:将arl-1基因插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1(His)6C和pQE-30。然后诱导表达ARL-1重组蛋白ARL-(His)6和ARL-GST。重组蛋白采用亲和层析纯化。用ARL-(His)6免疫家兔制备抗血清,以ARL-GST为配基制备亲和层析柱纯化抗血清,得到抗ARL-1多克隆抗体,多克隆抗体采用western blotting鉴定。应用该抗体,采用western blotting检测组织中的ARL-1蛋白,采用ELISA检测血清中的ARL-1抗原。 结果:分子量为35.7 KD的重组蛋白ARL-(His)6和分子量为60.8KD的重组蛋白ARL-GST都高度表达;表达水平分别占总蛋白的27.7%和15.1%。重组蛋白为可溶性的,主要集中在上清。采用非变性的方法纯化后,SDS-PAGE显示为一条带。在多克隆抗体纯化过程中只见到一个洗脱峰。Western blotting表明阳性信号只在两种纯化的重组蛋白和分别转有pGEX-4T-1(His)6C-ARL、pQE-30-ARL的大肠杆菌裂解液中见到。微量的ARL-1蛋白在许多正常组织中发现,包括十二指肠,小肠,升结肠,胆囊;但在肝脏,食管,胃,直肠,腹膜,卵巢,子宫,肾脏,扁桃体和睾丸没有发现ARL-1蛋白。ARL-1蛋白在94.4% (17/18)的肝癌组织表达,在82.4%(14/17)的相应癌旁组织表达。重要的是在肝癌组织ARL-1蛋白表达水平比癌旁组织高;在5例正常肝组织都没有检测到ARL-1蛋白。类似,在4种肝癌细胞系HepG-2、BEL-7402、QGY-7701、SMMC-7721和一种胚肝细胞系L-02检测到ARL-1蛋白,但在一种(源于成人肝外周组织)肝细胞系QSG-7701和鳞状细胞系Hacat没有检测到ARL-1蛋白。正常人血清ARL-1蛋白水平为24.81±2.51 ng/ml。我们将血清ARL-1蛋白高于27.32 ng/ml定为ARL-1阳性。在检测的108例肝癌血清,ARL-1阳性率为41.67%,AFP阳性率为60.19%,两者结合起来阳性率(只要ARL-1和AFP任何一种为阳性或两者都为阳性)为82.41%。 结论:制备了高度纯化和高度特异性的抗ARL-1多克隆抗体。重组蛋白ARL-GST、ARL-(His)6得到高表达和高度纯化。ARL-1蛋白在肝癌组织及血清中表达水平上调,血


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