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太湖蓝藻藻蓝蛋白提取纯化工艺研究

李辉东  
【摘要】:机械和人工打捞已成为治理蓝藻的重要应急措施,但打捞上岸的蓝藻处置不当会造成二次污染。本研究以打捞蓝藻无害化处理和资源化利用为目标,开展蓝藻藻蓝蛋白高附加值产品的开发和技术研究。目前,藻蓝蛋白类荧光试剂被国外垄断,进口价格极为昂贵,研发具有自主知识产权的藻蓝蛋白类荧光试剂生产技术具有重要意义。 采用冻融的方法对蓝藻进行破壁。研究了冻融次数、冻融介质以及不同原料状态对藻蓝蛋白纯度和得率的影响。结果表明:直接以藻泥提取藻蓝蛋白,以水为介质冻融两次为最佳破壁条件。所得藻蓝蛋白纯度为0.24,得率为0.90%。 分别采用不同孔径及不同压力条件过滤,絮凝的方法提取藻蓝蛋白。研究了过滤孔径、絮凝剂加入量以及絮凝藻液比对藻蓝蛋白纯度和得率的影响。结果表明:过滤法不适合去除藻渣;聚合氯化铝絮凝除藻效果明显。最佳絮凝条件为:藻液比1:6(蓝藻干物质含量为0.95%),藻水中聚合氯化铝浓度0.75%。此时,藻蓝蛋白纯度为0.31,浓度为0.19mg/mL,得率为0.79%。 为了进一步纯化藻蓝蛋白,先后采用盐析、双水相萃取和透析的方法,研究了硫酸铵饱和度、盐析步骤对藻蓝蛋白纯度和得率的影响;研究了双水相萃取体系、聚乙二醇浓度、磷酸钾盐浓度对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响;以及透析袋截留分子量对藻蓝蛋白纯度的影响。结果表明:采用20%-50%两步盐析的方法得到了纯度为2.23的藻蓝蛋白,得率为0.64%;在藻蓝蛋白萃取体系中,保持聚乙二醇(分子量为2000)与磷酸钾盐浓度均为14%,藻蓝蛋白纯度可提高至3.90,回收率为91.26%,最适合萃取纯化藻蓝蛋白;两步盐析后的藻蓝蛋白经截留分子量为100KDa的透析袋透析纯度可达4.20。经过两步盐析、透析和双水相萃取获得了最高纯度为4.60的藻蓝蛋白,符合国际公认的荧光试剂级藻蓝蛋白纯度标准(4.0)。 在藻蓝蛋白稳定性研究中,比较了不同试剂条件下藻蓝蛋白色素的衰减特征。在含有0.001mol/L磷酸盐缓冲液,0.002mol/L氯化钠,0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠,pH 6.8的溶液中,4℃遮光条件下,30天后藻蓝蛋白色素残存率高达91%,稳定性良好,适合长期储存。 根据试验结果提出了藻蓝蛋白提取纯化的工艺流程。采用“冻融,絮凝,两步盐析,透析和双水相萃取”的提取工艺可以高效、简便提取及纯化藻蓝蛋白。为蓝藻资源高价值化利用提供了一种有效可行的技术及工艺。


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