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产高温蛋白酶细菌的筛选及其酶学性质的研究

卞丽丽  
【摘要】:从南京汤山温泉样品中分离到18株产高温蛋白酶菌株。经过复筛,得到高温蛋白酶高产菌株TS1、TS2、TS3和TS4,并对其做了生理生化鉴定。经过牛奶滴板实验和液体发酵培养测酶活发现四株复筛菌株中TS1的酶活最高,故选TS1为液体发酵菌株。经过形态特征观察,初步鉴定菌株TS1为好氧芽孢杆菌属菌株(Oxybacillus sp.)。 设计多因素试验,考察了不同种类的碳源、氮源及各种金属离子的添加对菌株TS1产高温蛋白酶的影响以及不同培养温度、pH、接种量、接种时间对菌株TS1产高温蛋白酶酶的影响。获得最佳培养条件为:pH7.5,葡萄糖0.1%,酪蛋白浓度1.5%,乳糖浓度3%,酵母浸出汁5%,氯化钠0.5%,硫酸锌0.001%,温度50℃。在此优化条件下培养9h,上清液中蛋白酶的活力为36.5u/mL。其中酪蛋白、乳糖、酵母膏和激活剂Zn~(2+)以及温度对菌株TS1具有显著性影响。 菌株TS1发酵液经离心、硫酸铵沉淀、透析、Sephadex-G100离子交换柱层析、丙酮分级沉淀等分离纯化步骤,纯化后的高温蛋白酶样品活力为89.2u/mL较之纯化前蛋白酶的活力36.5u/mL相比,纯化倍数2.44。经SDS—PAGE分析,该酶由两个亚基组成,亚基的分子量分别约为20.72kD,18.14kD。在45-60℃内均有活力,最适反应温度60℃,最适pH7.5。Fe~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、EDTA不同程度地抑制该酶的活性,Zn~(2+)促进酶的活性。而Ca~(2+)不影响酶的活性。


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