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利用酵母双杂交系统筛选与BmNPVPE38和VLF-1相互作用的蛋白

管蕊  
【摘要】:家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是家蚕血液型脓病的病原,每年因该病毒感染家蚕都会对蚕业生产造成很大的经济损失。本研究通过酵母双杂交技术构建BmNPV感染的杂交文库,筛选与BmNPV核心基因Pe38、Vlf-1等互相作用的蛋白,可以更好地了解杆状病毒与其宿主之间复杂的相互作用机制。 采用CLONTECH SMART (switching mechanism at5′end of RNA transcript)技术,在酵母菌株Y187中构建感染BmNPV的家蚕中肠组织的cDNA文库。家蚕五龄第三天添食BmNPV,提取感染后12小时与96小时家蚕中肠组织的总RNA并混合均匀。进行长距离(LD)-PCR合成双链cDNA,后者经CLONTECH CHROMASPINTE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,即为感染BmNPV家蚕中肠组织的cDNA文库。实验结果表明:提取RNA的A_(260)/A_(280)=2.2,纯度较高;双链cDNA文库大于0.2kb,且弥散较长,成瀑布条带状;该文库具有基因多样性和足够大的库容量,滴度为4.4×10~7cfu/mL,文库扩增后,插入cDNA的长度为750bp-2000bp,该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础。 利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的蛋白PE38为诱饵,筛选感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库,寻找与之相互作用的宿主蛋白及其编码基因。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38、 pGBKT7-Vlf-1转化到酵母菌Y2HGold中,并将感染BmNPV家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38、pGBKT7-Vlf-1的酵母细胞共同培养,筛选与PE38、VLF-1编码蛋白相互作用的蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。未能筛选出与VLF-1编码蛋白相互作用蛋白。筛选到可能与PE38编码蛋白有相互做用的蛋白是:家蚕转化延伸因子2(translation elongation factor2);家蚕丝氨酸蛋白酶(Bombyx mori serineprotease);过氧化氢酶(actin, muscle-type A1catalase);膜蛋白(putative membraneprotein precursor);类糜蛋白酶丝氨酸蛋白酶前体(Bombyx mori chymotrypsin-like serineprotease precursor);家蚕A1肌动蛋白(Bombyx mori actin muscle-type A1);家蚕乙醇脱氢酶(Bombyx mori putative alcohol dehydrogenase);家蚕V-ATPase B亚基(Bombyxmori vacular ATPase B subunit)。


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