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重组胰蛋白酶大肠杆菌的发酵与表达

徐晓峰  
【摘要】:胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶家族的重要成员,广泛应用于食品生产、制药、临床诊断、生化检测等方面。在基因工程胰岛素的生产中,胰蛋白酶能将胰岛素原酶切为有活性的胰岛素。目前胰蛋白酶主要从猪、牛的胰脏中提取,但因其动物源性,存在未知病毒和外源因子污染的风险,且常因分离纯化不彻底,存在其它酶类(如糜蛋白酶等)对底物非特异性酶切的危险,故此种方法产生的胰蛋白酶在胰岛素等蛋白药物的生产和分析中的应用受到较大的限制。通过基因重组技术获得工程菌来表达胰蛋白酶原,可以产生高纯度与高活力的胰蛋白酶,满足蛋白质研究与药物蛋白生产的需要。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早,目前应用最广泛的表达系统。本文旨在探讨胰蛋白酶在大肠杆菌中的表达,为其工业化生产及应用提供研究基础。本试验首先对NCBI中公布的胰蛋白酶原基因序列进行了密码子偏爱性优化,将经过优化的胰蛋白酶原基因片段合成后连入p ET-22b(+),构建载体p ET22b-Trypsinogen,对载体进行酶切和测序验证后,再将载体转入宿主菌E.coli BL21(DE3),获得表达胰蛋白酶的工程菌,菌种命名为p ET-pro TYP。然后,本试验对工程菌的形态和生化特征进行了研究,并对工程菌传代稳定性进行了全面考察,以确定工程菌在今后的使用中能够稳定传代并表达目的蛋白。试验结果表明,重组胰蛋白酶工程菌具有典型的大肠杆菌形态和生化特征;经传代50代后,质粒稳定存在于菌种中,并能稳定表达目的蛋白,且工程菌传代稳定。随后,本试验对工程菌进行诱导表达,研究发现胰蛋白酶原主要以包涵体的形式表达。为获得大量含胰蛋白酶原的包涵体,本试验对工程菌进行了30L水平的高密度发酵,简单探究了高密度发酵的过程与控制。最终发酵结束后,通过离心得到了湿重102 g/L的菌体。对发酵情况进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示发酵后蛋白的表达量较高,通过灰度扫描显示其表达量为23.2%。实现了高密度、高表达的细胞发酵目的。最后,本试验对以包涵体形式存在的胰蛋白酶原进行了变形和复性处理,经肠激酶酶切后获得有活性的粗胰蛋白酶液,进一步对粗酶切进行纯化,并对纯化后的胰蛋白酶进行酶活测定,最后对高活力、高纯度的胰蛋白酶进行冷冻干燥处理。最终确定了包涵体的复性条件为:蛋白浓度0.3 mg/m L,100 m M甘氨酸-氢氧化钠体系,GSH/GSSG比例为1 mmol/L:0.3 mmol/L,复性缓冲液p H 10。此条件下复性后粗酶液酶活可高达6200单位/m L。复性后的胰蛋白酶原经过肠激酶过夜酶切,可以完全激活得到具有活性的胰蛋白酶粗酶液。粗酶液经过离子交换层析和疏水层析两步纯化,最后得到了纯度达95%,比酶活达到每毫克10526 BAEE单位的胰蛋白酶。其纯化条件经优化后为:疏水层析条件:缓冲液A-20 m M Tris-HCl+1.5 M(NH_4)_2SO_4,p H 8.0;缓冲液B-20 m M Tris-HCl,p H 8.0;0-100%B线性梯度50 CV。离子交换条件:缓冲液A-20 m M Tris-HCl,p H8.0;缓冲液B-20 m M Tris-HCl+1M Na Cl,p H8.0;0-100%B线性梯度30 CV。本试验成功构建了一株可用于生产胰蛋白酶的工程菌,试验中对工程菌的发酵表达和目标蛋白的复性纯化进行了研究,为工业化生产胰蛋白酶提供了理论基础。


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