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D-氨基酸的制备研究

韦萍  
【摘要】: 构成蛋白质的基本手性单元为L-型氨基酸,人们对L-氨基酸的研究已很详尽,而对其对映体D-氨基酸了解甚少。事实上,由于D-氨基酸在生化性质等方面具有自身显著的特性,它已被广泛用于合成抗生素和生理活性肽,并在医药、食品、农药等方面发挥了越来越重要的作用。迄今为止,尚没有专著来综述D-氨基酸的发展概况等,也未见到对D-氨基酸的制备方法进行系统研究的论著,有些D-氨基酸制备方法的报道也只针对某一具体的品种。 本文较全面论述了自然界中存在的D-氨基酸的性质、应用、制备及发展概况;系统研究开发了D-氨基酸制备的最佳方法——化学-酶法;深入探讨了D-氨基酸制备过程中的反应历程、机理和动力学行为,建立了可靠的化学-酶反应全过程数学模型;并用多种重要D-氨基酸的制备实验(有的已实现产业化)考察、验证了该技术的可行性、通用性、先进性。 本文的技术创新包括: 在国际上首创了常压法合成海因新工艺。海因的摩尔收率(对羟基乙腈)为86.2%,高于国外文献报道的高压法收率(83%),且海因品质优良。300吨/年工业化规模的海因生产技术指标均达到或超过国内外报道的最好水平。该技术已申请了专利,获得知识产权。 采用缩合-加氢法以海因为原料制备用于生产不同D-氨基酸的5-取代海因,优化了缩合、加氢过程的反应条件。缩合产物亚苄基海因、对羟基亚苄基海因和吲哚亚甲基海因收率分别为98.3%(文献值94%)、92.6%(文献值86.28%)和83.8%(文献值84.9%)。加氢产物苄基海因(反应2小时)、对羟基苄基海因(反应2小时)和吲哚甲基海因(反应5小时)收率分别为:90.1%、83.0%和70.0%。并首次在国内实现了苄基海因的工业化生产。 对来源易得和价廉的L或D,L-型氨基酸等原料(如L-缬氨酸,L-丙氨酸,D,L-蛋氨酸),采用氨基酸关环法制备5-取代海因,其中产物异丙基海因、甲基海因和甲硫乙基海因收率分别为94.5%、93.0%和96.2%。 对Burkholderia cepecia JS-01菌株进行了紫外及5-氟尿嘧啶的复合诱变和激 南京工业大学博士学位论文 摘要 光诱变,以竿基海因转化为D一苯丙氨酸的产物收率作为筛子,最终获得了转化 率高、性状稳定的一株菌株Burkh口ldcria‘印ecia 10娜。确定了该菌株发酵培养 基和诱导剂的最佳配方以及酶转化最适条件。用该菌株进行酶转化反应的最终产 物,D一苯丙氨酸的转化率达85.5%。 采用本论文的菌种与合成方法,用外消旋的5一取代海因实验合成了六种光 学纯的D型氨基酸:D一苯丙氨酸、D一色氨酸、D一酪氨酸、D一丙氨酸、D- 撷氨酸和D一蛋氨酸,其中D一苯丙氨酸己成功实现了工业化生产,D一色氨酸完 成了中试,充分证明本文开发的化学一酶法制备D一氨基酸技术的可行性、通用性 和先进性。 本文的理论成果为: 在二氢嗜睫酶和酞胺水解酶的催化机理基础上,首次提出海因酶(D一HEn)催 化机理模型,合理解释了酶催化过程。并且指出,海因酶的立体选择性是由于酶 的疏水性“口袋”决定的。其“口袋”太小,只能容纳海因环C一5位上的H,所 以D一海因酶只能催化水解D·型取代海因而生成N一氨甲酞一氨基酸。原料外消 旋体海因中存在的L一海因的消旋保证了海因酶的连续反应。 实验验证了前人关于N一氨甲酞一D一氨基酸水解酶伽一CAEn)酶活性部位存在 半肌氨酸的观点,但其“一SH’,基团并不参与氨甲酞催化水解过程。所提出的“袋 口”模型,解释了该酶容易失活的原因,并为优化反应条件、稳定酶的活性提供 了理论依据。 本文采用广义代谢工程的方法分析了在该酶转化反应体系中发生的多步传 质、反应的复杂过程,经合理简化,建立了化学一酶法转化全过程的数学模型: :一争一K(c;一味一c犯, (l) dC sL_ 气,户石厂- dC。n 二,-‘纽生二二 告‘(c;一C二一c二)一k,(c、 合‘(c;一c二一c。)十k,(c二 一cso) (2) CsD)一 ‘一二l鱼匕(3) K二+C肋 南京工业大学博士学位论文 rmC胡 K,+C胡 rmZC。- K,2+C,一+ (4) 脸勺 。2二踢_ 游~ 气ZC,1 。一弓 义、___,十七_1卞— ,”二川K, PI (5) 由实验数据拟合了模型参数。用该数学模型模拟酶转化全过程的结果与实验 数据吻合。该数学模拟方法可有效用于推断、预测该酶转化过程中的反应规律。 确证了属于底物抑制型的N一CAEn酶催化反应是该化学一酶法制备D一氨基酸 过程的控制步骤。采用连续加入原料的半分批式最优操作策略,可使体系中组分 浓度接近于该控制步骤的最适底物浓度,将该最慢反应的反应速率大幅度提高, 致使全过程达最优操作。首次采用正交模拟试验的方法分析了数学模型中各参数 对反应过程影响的显著性,优化了这些模型参数。、结果表明,N一CAEn的最大反 应速率rm:是影响转化过程最显著的因素;可采用基因重组、酶修饰等现代化生 物技术以提高rmZ。该研究结果对指导化学一酶法生产D一氨基酸的过程调控、优化 具有重要的理论意义。 本文所完成的D一Phe工业化试验为国


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