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L-乳酸生产菌株的诱变选育及发酵条件初步优化

周剑  
【摘要】:乳酸是目前世界上公认的三大有机酸之一,其广泛应用于食品、医药、化工、制革、纺织、环保和农业等诸多领域。目前随着白色泡沫污染日益严重,可生物降解的聚乳酸产品作为有可能取代造成环境污染的白色热塑产品也越来越受到人们的关注。目前化学合成法生产乳酸均为DL型,无法达到聚L-乳酸的要求。而用微生物发酵法生产L-乳酸可以得到较高的纯度要求。本研究采用凝结芽孢杆菌作为L-乳酸生产菌种,具有高温、厌氧发酵等优点,且L-乳酸光学纯度较高,符合工业化生产的要求。 本论文首先通过对一株产L-乳酸凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans进行紫外诱变选育筛选到一株产量提高6%的突变株,并考察其遗传稳定性。然后又通过低能离子注入法对其进行诱变,研究N~+离子注入凝结芽孢杆菌的生物学效应,考察不同能量、剂量下的诱变效果。经研究发现当注入能量为20KeV、剂量为50×10~(13)ions/cm~2~200×10~(13)ions/cm~2时诱变效果较佳。通过多次离子注入诱变选育筛选到一株L-乳酸产量提高20%的高产突变株,并将其命名为RS12-6C。 同时对高产突变株RS12-6C摇瓶发酵条件进行了优化。通过单因素试验,确定了菌株RS12-6C的最佳碳源及其浓度。从生产成本及工业化可行性考虑,选择玉米粉糖化液作为RS12-6C的碳源,研究发现含糖量为15%时产酸及糖酸转化率均较理想。发酵的最佳氮源是酵母膏,进一步研究发现可以使用廉价的棉籽蛋白代替部分酵母膏作为发酵氮源。最终确定较佳的发酵氮源配比为酵母膏1%、棉籽蛋白1%。通过对菌株RS12-6的培养条件进行了优化,确定了发酵的最佳接种量为10%;最佳发酵温度为50℃;最佳中和剂为轻质碳酸钙;并对菌种的发酵控氧条件进行了研究,确定溶氧条件为:摇瓶装液量40mL时50rpm培养15h后转入静止发酵;L-乳酸产量达到135g/L。 通过5L发酵罐分批发酵实验,以CaCO_3为中和剂,研究溶氧条件对凝结芽孢杆菌产酸的影响。以CaO乳液作为pH调节剂,研究了pH对菌体生长及产酸的影响。最后确定分批发酵时RS12-6C的最佳发酵条件为:发酵温度50℃、装液量4L、搅拌转速100rpm、通气1:0.15vvm时产酸速率及产量最大。在以上实验基础上通过流加补料葡萄糖,研究发现较佳的补料条件为:初始糖浓度7.5%,接种8h后以30ml/h的速度流加50%的葡萄糖至总糖浓度达到16%。在


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