固相合成胸腺五肽的分离与纯化

【摘要】：胸腺五肽(Thymopentin,TP5)是一种小肽,是由五个氨基酸组成的化合物,它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间。胸腺五肽(TP5)是合成的五肽,TP5是胸腺生成素Ⅱ上的活性中心第32～36位氨基酸序列,具有胸腺生成素Ⅱ的全部生理功能。主要生理功能是诱导T细胞的分化、增殖和成熟,临床上主要用于治疗肿瘤、单纯疱疹、类风湿性关节炎、艾滋病、严重免疫缺陷综合症、慢性乙型肝炎。 本文对TP5的分离方法进行了研究,主要对离子交换方法和反相高效液相方法进行了研究,并进行了规模放大。主要研究内容如下: 1) 对TP5的理化性质进行分析。首先用Anthwin软件分析了TP5的等点电、滴定曲线、疏水性;接着对TP5进行了实验测定,结果测得TP5的疏水性常数为—1.4,为亲水性物质,同时对其稳定性进行研究,结果表明其在水溶液中短期具有一定的稳定性。综合考虑分析的结果,认为采用阳离子交换法和反相液相法分离TP5较合适。 2) 对离子交换法分离TP5的条件进行了摸索。通过对树脂的筛选、缓冲溶液的选择、缓冲溶液不同pH值的比较、洗脱梯度的选择,并对色谱行为进行比较分析和HPLC分析。结果表明采用pH4.4的醋酸缓冲溶液,使用SP Sepharose FF树脂,在梯度10 ml内流动相B从0%～40%、10 ml内流动相B从40%～100%下的分离效果较好。 3) 再对SP Sepharose FF树脂对TP5的吸附进行了研究,包括静态吸附和动态吸附。实验测得吸附速率常数k=0.0396 s~(-1),对等温吸附线进行拟合,符合Langmuir吸附,为单分子层优惠吸附,公式为q=128.44·c/(2.38+c),q_m=128.44mg/g·resin,pH值对吸附的影响较大,选择pH4.4对吸附较为有利。再对动态吸附行为进行了研究,考察了上样浓度和上样流速对吸附的影响,结果认为在浓度为16 mg/ml和流速为2.0 ml/min条件下上样较好。最后对动态吸附进行建立了模型拟合,拟合结果与实验相符。 4) 对反相高效液相分离TP5的条件进行研究。比较了分离柱、离子对试剂浓度、洗脱梯度对分离的影响。结果表明使用MKF分离柱,使用0.1%的TFA试剂,在梯度30 min内B相浓度从5%～30%条件下分离的效果较好。