应用霉菌单加氧酶羟基化齐墩果酸的研究

【摘要】： 天然产物化学成分齐墩果酸是五环三萜类化合物,具有保肝、降血糖、抗病毒等多种生物活性,应用前景广阔。但是齐墩果酸生物利用度低,制剂种类单一,限制了其生物活性的开发。修饰改造其分子结构,从而提高生物利用度,替代天然植物成分,达到保护环境、创制新药的目的。本研究旨在采用微生物转化法制备C_(11)-羟基齐墩果酸,在庞大而复杂的分子结构中引入C_(11)-OH活性基团,以便提高齐墩果酸的生物活性和提供进一步化学修饰的可能性。 首先,通过对本实验室保藏的霉菌进行筛选,得到了具有酶催化转化齐墩果酸能力的酶源菌株赭曲霉Aspergillus ochraceus NG0216;以此为出发菌株,通过离子束诱变,筛选得到一株高产菌株Aspergillus ochraceus NG1203,对齐墩果酸的生物氧化转化率由2.29%提高至6.74%,且遗传性状稳定,由此得到了本课题的实验菌株。初步微生物催化转化实验得到的生物转化产物通过HPLC、MS、IR、~1H-NMR和~(13)C-NMR分析,结果表明产物为11α-羟基齐墩果酸。 此外,通过补加葡萄糖和流加H2O2的方式考察齐墩果酸羟基化的反应机理,佐证了齐墩果酸羟基化反应是单加氧酶催化反应。实验结果还表明从48 h起每日补加葡萄糖10 g/L能保证较高的转化率;菌体培养96 h始流加H2O2,最终浓度达到5 mmol/L能够大幅度提高转化率。 此后,对Aspergillus ochraceus NG1203转化齐墩果酸11α-羟基化工艺进行研究。通过单因素实验和正交实验,确定了摇瓶最佳培养基配方:葡萄糖20 g/L,玉米浆26 g/L,酵母膏3 g/L,K2HPO4 1.5 g/L。在优化的培养基条件下,发现加入有机溶剂和对羟化酶进行预诱导,可以提高底物的转化率。经优化操作条件得到:选择乙醇作为有机溶剂,在反应液中最终的浓度为3%(V/V),加入2 mg/L的齐墩果酸作为诱导剂,24 h后,分批添加,齐墩果酸的转化率可达到13.24%。 最后,对水/有机相两相体系羟基化齐墩果酸进行了初步研究:选择乙酸丁酯作为两相酶转化体系中的有机相;采用响应曲面实验设计对乙酸丁酯与水的体积比、齐墩果酸在乙酸丁酯中的浓度和摇床转速三个因素进行了优化。得到以转化率为响应的拟合方程: