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酿酒酵母skp1和rav2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

张光明  
【摘要】:V-ATP酶(vacuolar ATPase)又称液泡ATP酶,是一种广泛存在于真核生物细胞膜结构中靠水解ATP产生的能量来转移质子从而调节细胞内外pH值的一种ATP酶。V-ATP酶在环境中的葡萄糖浓度降低时可以可逆分解为V0和V1两部分来调节酶的活性。RAVE (regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membranes)复合物在V-ATP酶此种活性调节方式中起到重要作用。RAVE复合物由Skplp、Ravlp和Rav2p三个亚基组成。目前有关RAVE结构和性质以及RAVE对V-ATP酶活性调节机理的研究很少。 根据NCBI报道的来源于酿酒酵母的skp1基因序列和表达载体pET-21c设计引物,然后以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板扩增skp1。将纯化后的PCR产物直接用Nde I和Not I双酶切,然后与经同样双酶切的表达载体pET-21c连接构建重组质粒pET-21cS1。经PCR和双酶切验证后的质粒再经DNA测序进一步验证,克隆的基因完全正确。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经1 mmol/L的IPTG,25℃诱导4 h,表达出Skplp。诱导后的大肠杆菌经超声细胞破碎,再经Ni-NTA凝胶纯化得到可溶的目的蛋白。 以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板扩增rav2。将纯化后的rav2与pUCm-T载体相连构建重组质粒命名为pUCTR2。将质粒pUCTR2用Nde I和Not I双酶切,然后胶回收rav2,并将其与经过同样酶切的表达载体pET-21 c相连构建重组质粒pET-21cR2。经PCR和双酶切验证后的质粒再经DNA测序进一步验证,克隆的基因完全正确。将重组质粒pET-21cR2转入大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌在1 mmol/L IPTG,25℃,150r/min的诱导条件下表达出目的蛋白Rav2p,但大部分为包涵体。经过表达条件的优化,发现在LB培养基中添加0.5%的葡萄糖并在0.5 mmol/L的IPTG,16℃,80r/min条件下诱导10 h可得到更多可溶的Rav2p。诱导后的大肠杆菌经超声破碎,再经Ni-NTA凝胶纯化得到可溶的样品。 根据SOPMA的预测,酿酒酵母的Rav2p中含有46.72%的α螺旋,17.66%的p折叠,4.84%的β转角和30.77%的无规则卷曲。在NCBI中BLAST的结果显示:酿酒酵母的Rav2p与Zygosaccharomyces rouxii中的ZYRO0C04554p同源性为49%;与Vanderwaltozyma polyspora中的Kpol_1064p58同源性为49%;与Ashbya gossypii中的AGL104Cp的同源性为45%。酿酒酵母Rav2p氨基酸序列的保守区分析显示,Rav2p属于Rogdi-lz家族中功能未知的一种蛋白。Rav2p中含有20个含硫氨基酸和13个脯氨酸,这种氨基酸组成可能是造成其在大肠杆菌中易形成包涵体的重要原因。 以构建好的重组质粒pET-21cR2为模板扩增rav2。将纯化后的rav2与共表达载体pETDuet-1经BamH I和Sal I双酶切后连接构建重组质粒pETDuet-R2。经PCR与双酶切验证,选择正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经1 mmol/L的IPTG,25℃诱导2h后表达Rav2p。以构建好的pET-21cS1为模板扩增skp1。将纯化后的skp1直接用Nde I和Xho I双酶切,然后与经同样双酶切的重组质粒pETDuet-R2相连构建共表达质粒pETDuet-R2Sl.将共表达质粒pETDuet-R2Sl经PCR与双酶切验证后再经DNA测序进一步验证,证明skp1与rav2均克隆正确。含共表达质粒的BL21(DE3)在终浓度为1 mmol/L的IPTG,25℃,150 r/min的诱导条件下诱导6 h,SDS-PAGE显示没有出现目的蛋白条带。诱导条件改为1 mmol/L的IPTG,37℃,150 r/min后,诱导2h时,表达出Skplp但是没有表达出Rav2p,诱导4h时,表达出Skp1p和Rav2p。


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