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桦褐孔菌多糖纯化、结构及其抗肿瘤机制研究

陈义勇  
【摘要】:桦褐孔菌(Inonotus obliquus (Fr.)Pilat)属于多孔菌科(polyporaceae)、褐卧孔菌属,主要分布在北纬45°-50°地区,如北美、芬兰、波兰、俄罗斯、中国的黑龙江和吉林(长白山)、日本等国家和地区。桦褐孔菌无明显毒副作用,具有抗癌、治疗糖尿病、预防艾滋病、抗衰老、增强免疫力等功能。桦褐孔菌多糖具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节、抗氧化等作用,目前国内外对桦褐孔菌及其多糖的研究相对还比较薄弱,对桦褐孔菌多糖分离纯化、结构、抗肿瘤作用机制的研究鲜有报道。本论文在桦褐孔菌粗多糖(IOP)提取、初步纯化的基础上,系统研究了IOP的理化性质、抗肿瘤活性,并对lOP进一步分离纯化,筛选抗肿瘤活性强的单一组分IOP3a,并对其结构特征、体内抗肿瘤活性机理以及诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制进行了研究,研究结果如下: 分析了桦褐孔菌原料组成:水分3.5士0.36%,粗蛋白2.4±0.44%,粗脂肪1.7±0.25%,灰分10.4±0.44%,粗纤维67.5±0.95%,还原糖4.2±0.30%,多糖10.3±0.40%。 通过正交实验确定了传统水浸提IOP的最佳工艺参数:提取温度90℃,时间4h,料液比1:30(W/V)。运用响应面分析方法,确定了超声-微波辅助提取IOP最佳工艺参数:微波功率90W,料液比1:20(W/V),提取时间19min。与传统水浸提法相比,超声-微波辅助提取时间短,多糖得率从2.12%增加到3.25%,纯度从64.03%增加到73.16%。通过红外光谱分析两种提取方法所得的多糖结构基本相同,超声-微波辅助提取法优于传统水浸提法。脱色和脱蛋白实验证实聚酰胺吸附柱层析法为IOP脱蛋白和脱色的理想方法。 研究了IOP的理化性质,并对其进行抗肿瘤活性评价。IOP干品呈现淡咖啡色,无味,易溶于水,但不溶于无水乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂。多糖、糖醛酸含量相对较高,不含蛋白质,单糖组成为Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal,摩尔比为10.25:9.38:1:12.45:9.9:11.55。采用HPLC凝胶色谱柱测定IOP的相对分子质量为156611Da。黏度性质研究表明lOP在一定的温度范围内随着温度的升高,黏度逐步增加,超过一定温度后,其黏度变化很小,pH对其黏度影响不大,金属离子影响显著,其中Ca2+、Mg2+影响较大,K+、Na+影响较小,低浓度尿素可使黏度增加,过高浓度可使黏度下降。体外抗肿瘤活性表明IOP在体外具有直接杀死Jurkat和Daudi肿瘤细胞的作用,最高抑制率分别为62.29%和66.42%,具有良好的剂量-效应关系,体内抗肿瘤活性表明IOP体内抗肿瘤活性显著,大小剂量对Jurkat荷瘤的抑制率分别为57.48%和43.52%,能显著提高裸鼠的脾脏指数,有效保护裸鼠免疫器官,对Jurkat肉瘤裸鼠单核巨噬细胞吞噬功能有明显的增强作用。 对lOP分级纯化并对组分进行抗肿瘤活性筛选,DEAE-SepharoseCL-6B柱分离纯化得到4个多糖组分:IOP1为中性多糖,IOP2、IOP3和IOP4为酸性多糖,多糖的回收率达85.6%。对四个组分进行体外抗肿瘤活性筛选,筛选出抗肿瘤活性较高的组分IOP1和IOP3。 IOP3和IOP1经过SepharoseCL-6B凝胶柱色谱洗脱分离,分别得到两个相对分子质量不同的组分IOP3a、IOP3b和IOPla、IOPlb,对其体外抗肿瘤活性进行筛选,实验结果表明,IOP3a和IOPlb活性较强,采用凝胶柱层析、HPLC和琼脂糖凝胶电泳法鉴定表明IOP3a和IOPlb为均一性组分。经HPLC测定IOP3a相对分子质量为44265Da,IOPlb相对分子质量为153172Da,通过气相色谱测定IOPlb单糖为葡萄糖,推测是一种p-葡聚糖。 通过建立裸鼠Jurkat模型,对IOP3a的体内抗肿瘤活性及其机制进行了研究,实验结果表明,IOP3a高、中剂量组瘤重与阴性对照组相比均有显著性差异(p0.05),肿瘤抑制率分别为69.28%和57.62%,具有明显的剂量-效应关系。随着剂量的增加,脾脏指数有逐步增加的趋势,具有升高裸鼠WBC和淋巴细胞的功能。组织病理学观察表明,IOP3a可使肿瘤组织中呈现明显的肿瘤坏死灶,瘤组织出现坏死的现象。通过免疫组化表明IOP3a体内抗肿瘤机制:通过促进肿瘤组织细胞中Bax蛋白表达、抑制Bcl-2表达起到抗肿瘤作用。 采用光学显微镜、扫描电镜、荧光显微镜、流式细胞术及蛋白质印迹等技术,探讨IOP3a诱导肿瘤细胞Jurkat和Daudi凋亡机制,实验结果表明,IOP3a作用后肿瘤细胞形态有明显差异,光镜下Jurkat和Daudi细胞分布不均匀,部分皱缩,形态不规则。荧光显微镜下细胞核呈致密浓染,呈现亮蓝色,呈现凋亡细胞特征。扫描电镜下细胞膜上大量微绒毛消失,最终脱落形成膜包被的凋亡小体。FITC-AnnexinV/PI双染色法检测结果表明IOP3a作用Jurkat和Daudi细胞48h后,细胞凋亡率分别为16.8%和23.1%。通过蛋白质印迹技术检测Cytc的释放和caspase-3酶的表达,借助于DNA ladders凝胶电泳分析,确定IOP3a诱导肿瘤细胞凋亡机制:通过刺激肿瘤细胞线粒体释放Cytc,活化caspase-3进而激活内源性核酸内切酶,引起DNA裂解实现其抗肿瘤作用。 通过甲基化分析方法,结合GC-MS.NMR和FT-IR等测试手段对IOP3a的结构进行分析,结果显示:IOP3a是由→4)-α-GapA(1→通过O-4位与→2)-α-Rhap(1→、→2,4)-α-Rhap(1→连接形成主链,主链中的→2,4)-α-Rhap(1→通过O-4与其它糖残基连接形成支链。→4)-β-Galp(1→、→6)-β-Glcp(1→、→5)-α-Araf(1→聚合形成半乳聚糖、葡萄聚糖和阿拉伯聚糖是IOP3a侧链的主要组成,其支链通过Gal残基、Glc残基和Ara残基的O-1位与主链的Rha残基的O-4相连。侧链→6)-β-Galp(1→构成的半乳聚糖通过O-4和O-6产生分支,侧链→5)-α-Araf(1→构成的阿拉伯聚糖通过O-3产生分支。 通过刚果红实验和紫外光谱手段对其构象进行研究,表明IOP3a是一有序的三股螺旋结构,温度对其构象没有太大的影响,酸、碱和金属离子能引起IOP3a三股螺旋构象发生了一定程度的改变,热重分析表明IOP3a在170-500℃之间发生分解,出现快速失重。


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