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伯克霍尔德菌的筛选、鉴定及其发酵产低温脂肪酶的研究

苑博华  
【摘要】:脂肪酶能够催化甘油三酰酯水解,是重要的工业用酶之一。低温脂肪酶在低温下具有高催化活性的特点,具有广阔的应用前景。低温脂肪酶多为低温微生物产生,此类菌生长条件相对苛刻,严重制约了低温脂肪酶的发展。因此,筛选和研究产低温脂肪酶的嗜温菌具有一定的理论意义和潜在的应用价值。 从银杏果实中筛选得到一株稳定产低温脂肪酶的伯克霍尔德菌,并对其进行了鉴定,研究了其发酵产脂肪酶的条件、脂肪酶的分离纯化和性质以及烷烃类物质对该菌产脂肪酶的影响和机理,并对该基因进行克隆、表达及序列分析,主要结果如下: 1)利用维多利亚B平板显色特征和产脂肪酶能力测定,筛选得到一株产脂肪酶的菌株,经形态学、分子生物学、DNA GC含量和脂肪酸含量的鉴定,命名为Burkholderia sp. SYBC LIP-Y,其16S rRNA基因序列的GenBank登录号为FJ392830。 2)用响应面法对Burkholderia sp. SYBC LIP-Y液体发酵产低温脂肪酶的发酵条件进行了快速优化。首先利用Plackett-Burman设计对影响其产酶相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的三个因素:牛肉膏,橄榄油,Triton X-100:用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,确定出牛肉膏,橄榄油,Triton X-100的最佳浓度分别为:牛肉膏31.8g/L、橄榄油21 mL/L、Triton X-100 36.55 mL/L,优化后脂肪酶的酶活达到61.52 U/mL,是优化前的2.62倍。对5L发酵罐中Burkholderia sp. SYBC LIP-Y的发酵产酶条件和工艺进行了优化,确定了最佳产酶培养基以及发酵工艺参数:接种量为10%,Triton X-100 5 mL/L,橄榄油10 mL/L、牛肉膏40g/L、搅拌速度为300r/min,通气量为3.5 L/min,在此培养条件下,培养36 h产酶达到高峰值,产酶水平与摇瓶培养基相当,发酵时间缩短了12 h。 3)通过双水相系统、DEAE-cellulos52和Sephadex G-75分子筛层析纯化得到的脂肪酶进行酶学性质研究,确定该酶反应的最适pH值为10.0,最适温度为30℃,40℃下保温60 min酶活性还有70%以上,该脂肪酶为低温脂肪酶,热稳定性好,具有一定的耐醇性;蛋白分子量为36 kDa; Na+、Mg2+对脂肪酶的活力有明显的促进作用,Cu2+和Zn2+对脂肪酶的活力有明显的抑制作用;非离子型表面活性剂Tween-40和Tween-60对脂肪酶活性有显著的的激活作用,Tween-80对脂肪酶的活性有一定的抑制作用;最适作用底物为p-NPB, Km值为0.120 mmol/L, Vmax为400 U/mg, Kcat为240 S-1。 4)考察了短链烷烃和长链烷烃对菌株Burkholderia sp. SYBC LIP-Y的摇瓶发酵产酶的影响,结果表明,短链烷烃庚烷、辛烷、癸烷对菌株产脂肪酶具有非常大的抑制作用,长链烷烃十二烷、十四烷、十六烷对Burkholderia sp. SYBC LIP-Y产脂肪酶具有很明显的刺激作用,添加4%(v/v)的十二烷的发酵液的酶活是对照组酶活的2倍左右。在脂肪酶酶活提高时,氧化水平提高,丙二醛、H202、抗坏血酸含量以及SOD、CAT活力明显上升,可能由于长链烷烃作用于细胞膜上,从而启动了抗氧化机制,促进了信号传递,因此促进Burkholderia sp. SYBC LIP-Y产脂肪酶的机制可能与抗氧化机制有关。 5)经PCR扩增得到脂肪酶基因,与Burkholderia相应基因具有很高同源性。脂肪酶基因全长1095 bp,可编码364个氨基酸残基;此克隆序列的氨基酸残基129-133处为脂肪酶的高度保守区域即活性中心序列GXSXG;脂肪酶蛋白N端存在信号肽序列。以Swiss-MODEL分析了三级结构。构建了大肠杆菌表达载体pET22b-lipase,并在E. coli BL21中得到成功表达,表达的部分蛋白以包涵体形式存在。


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