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高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌在不同供氧条件的差异蛋白质组学研究

陶帅  
【摘要】:L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)作为一种条件性必需碱性氨基酸,是合成蛋白质、磷酸肌酸的重要原料,也是生物体内尿素循环的重要中间产物,对生物体维持正常的生理功能有重要作用。因此,L-精氨酸在食品、化妆品、临床医药等领域有广泛应用,市场需求量不断增加。 本论文所用菌株钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5为本实验室保藏的一株L-精氨酸高产菌株。前期研究表明C. crenatum SYPA5-5为好氧菌株,且供氧水平对菌体生长及L-精氨酸的合成均具有极其重要的影响,氧的供应不足不仅会抑制菌体生长,还会严重抑制L-精氨酸的合成。满足菌体高的氧需求通常有两种方法:一是提高发酵过程中发酵液的溶解氧水平,另一途径则是利用基因工程手段来提高菌体自身对氧气的利用效率。 本文分别通过在摇瓶发酵中设定不同的装液量及在5 L自控发酵罐分批发酵中设定不同转速的方法,建立了两类供氧差异模型,并测定了不同供氧条件下的C. crenatum SYPA5-5的发酵特性。 在发酵过程中,通过双向电泳(2-DE)、质谱鉴定及数据库检索等技术,对不同供氧条件下C. crenatum SYPA5-5胞内可溶性蛋白进行差异分析。在不同时期,不同供氧条件下,共鉴定了109个差异蛋白,包括与碳源代谢、氨基酸代谢、能量代谢、翻译相关、次级代谢相关的蛋白及一些未知功能的蛋白。通过代谢途径分析发现:这些差异蛋白主要集中在HMP途径、TCA循环及尿素循环。高供氧(HOS)条件下,这些途径都有所增强,尤其是HMP途径,这与本实验室前期的代谢流量分析结果一致。 由于HMP途径不仅调控着葡萄糖代谢的流向,还为细胞提供NADPH。因此HMP途径的增强为细胞提供了更多的NADPH,不仅为细胞提供还原力,缓解氧毒性,还作为精氨酸合成途径中N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶的辅酶催化L-精氨酸的合成。NAD激酶可将胞内NAD(H)转变为NADP(H)。因此,本论文成功构建了携带有NAD激酶基因ppnK的表达质粒pJC1-tac-ppnK,并分别转入E.coli JM109和C. crenatum SYPA5-5。对重组菌株C. crenatum(pJC1-tac-ppnK)的发酵特性进行分析,结果显示,采用优化后的培养基重组菌C.c.(pJC1-tac-ppnK)L-精氨酸产量可达52.25 g·L~(-1),较出发菌株(45.17 g·L~(-1))提高了15.66%。重组菌株的糖酸转化率(YP/S)的由33.48%提高到了36.62%。


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