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基于LC-MS/MS法的色氨酸合成代谢组学分析平台的构建

梅辉  
【摘要】:随着微生物法生产色氨酸研究的不断进展,利用微生物生产色氨酸已经走向实用并且处于主导地位。为了进一步提高色氨酸的产量,微生物代谢组学便应运而生。微生物代谢组学研究涉及到对大量代谢物同时进行定性和定量分析,这就要求建立一个能够分析代谢网络中代谢流的变化以检验分子改造效果的技术平台。本文通过对一系列液相色谱和质谱参数进行优化,建立了色氨酸合成代谢组学LC-MS/MS分析方法;将此分析方法应用于E. coli代谢组学样品前处理关键步骤的考查,从而优化出最佳的前处理方法,建立色氨酸合成代谢组学的分析平台;利用此平台对E. coli发酵后期代谢流和代谢节点进行分析。主要结论如下: 1.建立了一种快速、准确的同时测定大肠杆菌(E. coli)24种胞内代谢中间产物的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法。样品经Waters Atlantis HILIC silica色谱柱分离,以乙腈-10 mM/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为250μL/min。电喷雾负离子(ESI-)模式电离,多反应监测模式(Multiple reaction monitoring,MRM)监测,基质标准溶液法定量。结果表明:24种代谢物在0.10~100μM/L范围内呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99;24种代谢物的检出限(S/N3)为0.05~0.34μM/L,三个添加水平的回收率为83.7%~108.1%,相对标准偏差(RSD)均小于10%。 2.比较研究了基于液相色谱和质谱联用技术(LC-MS/MS)的E. coli菌体淬灭、洗涤和胞内代谢物的提取方法,并对细胞破碎方法和破碎次数进行了考查。结果显示:在淬灭过程中,甘油-NaCl溶液能较好的保持细胞的完整性,防止代谢物的泄漏,0.9%NaCl能较好的维持细胞的渗透压,是菌体洗涤溶液的较好选择;在对样品进行淬灭和洗涤后,冷甲醇提取法所得到的相对提取率最高,且重复性好(RSD5%),液氮冷冻法对胞内代谢物的提取较超声波破碎法更为彻底,且不会导致热敏性物质的转变;胞内代谢物通过液氮反复冻融四次可以得到最多的胞内代谢物。 3.通过产色氨酸E. coli代谢流平衡模型的建立和代谢节点分析,得到PEP节点和G6P节点处的代谢流向,为提高色氨酸的得率指明方向。


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