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L-苯丙氨酸发酵条件的优化与控制

王静  
【摘要】:L-苯丙氨酸(L-phenylalanine, L-Phe)是一种广泛应用于食品、饲料添加剂以及医药等领域中的必需氨基酸,主要的工业生产方法为原料廉价易得,环境污染小的微生物发酵法。目前存在的问题有:用于工业生产的大肠杆菌经常会感染噬菌体病毒;L-酪氨酸(L-Tyr)作为对缺陷型生产菌株发酵过程的重要限制性底物,其补料方式需进一步深入研究;葡萄糖作为主要碳源有产生乙酸等副产物等缺点,尚未有新的可能性替代碳源的开发研究。根据上述问题,本论文的主要研究内容及结果如下: 1从经常受到噬菌体感染的菌株WSH-Z06 (pAP-B03)的异常发酵上清液中利用双层平板法分离得到了两株不同的噬菌体BP-1及BP-2。以大肠杆菌WSH-Z06为出发菌株,通过在紫外诱变后培养阶段直接加入纯化后的两种噬菌体进行淘汰培养后筛选到一株双重噬菌体抗性的菌株WSH-BR165 (pAP-B03),其L-Phe的生产能力与出发菌株相当,而且在添加了噬菌体的发酵过程中表现稳定。 2在发酵过程中恒速流加L-Tyr可促进细胞保持着比生长速率不断减小的生长状态,提高菌体量并提高L-Phe的生产强度,缩短发酵时间。同时指数流加L-Tyr和葡萄糖可将流加阶段的菌体生长速度保持在恒定值,通过分别在升温诱导后/前进行双指数流加实现高密度的两组实验,分别实现了L-Phe的生产和菌体的生长的相结合/分离,从而对比研究了在大肠杆菌WSH-BR165 (pAP-B03)不同生理条件下的L-Phe生产过程。在L-Phe的生产过程中保持着菌体的生长可以在节约底物的同时实现较高的生产量和生产强度,而当L-Phe的生产与菌体的生长相分离时则需消耗更多的底物,是比较不经济的高密度培养方法。通过高密度培养条件下对稳定期和生长期的L-Phe生产情况的对比得出,提高的生产强度不仅由提高的高浓度菌体引起,比生产速率也是其原因之一。在诱导后保持μset =0.09 h-1的生长阶段生产L-Phe的过程中,最终的菌体干重为43.16 g/L (对照的3.04倍,对照为未双指数的发酵过程),葡萄糖的总消耗量为191.66 mL(对照的84.7%),L-Phe的产量为44.53 g/L(对照的1.06倍),生产强度为1.484 g/L/h(对照的1.69倍)。 3以甘油替换葡萄糖进行发酵过程的研究,根据对菌体生长量的影响优化了初始培养基中甘油的浓度,得出最优的初始甘油添加量为30 g/L。在甘油的补料分批发酵的条件下,考察了在pH-stat流加(对照),恒速流加和恒底物浓度流加三种流加方式下的L-Phe发酵过程,得出在底物浓度保持在5 g/L时的发酵过程最优,最终的L-Phe产量为48.61 g/L(对照的1.32倍),生产强度为0.972 g/L/h(对照的1.42倍)。保持5 g/L恒底物甘油浓度的发酵过程与同样流加方式下的葡萄糖为碳源的过程相比,L-Phe的产量提高了15.6%,而产物对底物的质量得率提高了18.9%,说明了在L-Phe的发酵过程中甘油较葡萄糖而言是较优的碳源。根据对甘油消耗量和氨水消耗量的关系的研究,得出了两者间的线性拟合关系式y=6.686x+89.329,在实际发酵操作中,保持甘油流加速率是氨水流加速率的5.67倍时的发酵过程重要参数同于5 g/L的恒底物发酵过程,而甘油浓度一直被保持在10 g/L以下。


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