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脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原设计及直接竞争酶联免疫方法

金萍  
【摘要】:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)半抗原的分子设计是建立其免疫分析方法的关键步骤,目前,DON半抗原设计仍采用经验法,造成时间和资金的浪费。本文从半抗原设计的最大原则(不改变待分析物的结构性质)出发,明确DON最佳半抗原的设计思想:最大化抗原表位相似度。利用分子模拟技术,通过分析分子的空间构型、电子特性、疏水性质这几个影响抗原-抗体间作用力的因素在DON修饰前后的变化,研究半抗原结构与免疫识别之间的关系,建立DON半抗原设计的理论模拟方法,为小分子半抗原设计提供新的思路,并在此基础上建立了DON的直接竞争酶联免疫分析方法。 根据DON抗原设计流程:选择结合位点→引入连接臂→偶联载体蛋白,首先研究结合位点对DON免疫识别的影响,在DON分子中的4个潜在结合位点(3 ,7 ,15位羟基以及8位酮基)引入相同碳链长度的的连接臂,借助分子模拟软件Hyperchem7.5对DON及半抗原的表位决定参数(空间结构、原子点电荷、疏水常数)进行计算分析,3位半抗原具有与DON最相似的结构性质,表明3位是DON引入连接臂的最佳位点,这与Casale和Ramesh的免疫实验结果一致。 其次,在3位羟基上设计不同的连接臂结构,通过抗原表位相似度模拟筛选得到最佳连接臂结构:丁二酸酐臂。同时合成不同连接臂的DON完全抗原,并将之进行免疫抗体实验,测定抗体的效价以及抑制率,验证分子模拟结果,研究半抗原结构对抗体免疫活性的关系。结果表明B组(顺丁烯二酸酐臂)抗体平均效价:256000,A组(丁二酸酐臂)、C组(邻苯二甲酸酐臂)平均效价:64000; DON浓度为500 ng/ml时对抗体的抑制率分别:A组(66.4 %)B组(21.1 %)C组(10.8 %)。抑制率的大小与抗体对DON的特异性相关,A组与DON具有最高的抗原表位相似度,抗体对DON的特异性强,抑制率高;抗体的效价可以反映半抗原分子的抗原性,苯环结构、不饱和键可以增强抗原性,B组连接臂中含有不饱和键,增强了半抗原的抗原性,产生的抗体效价高;C组虽含有苯环结构,确未能产生高效价的抗体,结合其空间结构发现C组半抗原中羧基端与半抗原主体结构非常靠近,半抗原结构可能被载体蛋白屏蔽而影响免疫识别;综合考虑,丁二酸酐臂是DON的最佳连接臂,免疫试验结果与分子模拟具有很好的相关性。 在最佳半抗原基础上,比较BSA和KLH两种载体蛋白的DON完全抗原的免疫原性。通过丁二酸酐衍生法和碳二亚胺法(EDC法)制备不同载体蛋白的DON完全抗原,免疫新西兰长耳兔获得DON抗体,并运用酶联免疫方法(ELISA)对制备的抗体进行研究。 在上述研究结果基础上合成DON-KLH完全抗原,建立DON的直接竞争酶联免疫分析方法,通过一步抗原抗体反应,快速检测食品中DON。检测范围为1 -100 ng/mL。半数抑制率IC50为10 ng/mL,最低检出限为0.56 ng/mL,与T-2毒素等真菌毒素的交叉反应率小于12 %;平均批内变异系数为2.82 %,平均批间变异系数为14.54 %;对玉米粉的加标回收率在80.2-91.1 %,准确性较高;与商品化试剂盒相比具有所需时间短,精密度高,灵敏度高的优点。 本研究表明分子模拟方法对DON半抗原设计有积极作用,指导半抗原设计,减少半抗原设计中时间及资金的投入。不同载体DON免疫抗原的免疫原性不同,DON-KLH免疫原性优于DON-BSA。6本研究所建立的DON的直接竞争ELISA方法,快速、方便,具有较好的实用价值,为进一步研究DON的ELISA检测试剂盒提供了重要的实验依据。


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