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麦芽糖基-β-环糊精的酶法合成及其性质和应用研究

崔波  
【摘要】:麦芽糖基-β-环糊精(Mal-β-CD或者G_2-β-CD)是分支环糊精的一种,是在保留环糊精空腔结构基本不变的情况下,采用化学或生物酶法向环糊精母体的6位羟基接枝麦芽糖基而得到的改性产物。麦芽糖基-β-环糊精既具有普通母体β-环糊精所具有的包合性能,同时又具有β-环糊精所不具有的极好的溶解度,因此在食品、医药、农药、精细化工、分析检测、环保等行业具有巨大的应用前景。本论文从商品普鲁兰酶液中分离得到普鲁兰酶,对所用普鲁兰酶的性质进行了研究,详细研究了普鲁兰酶反向催化合成麦芽糖基-β-环糊精的机制,并通过计算化学阐述了反应的可行性,对普鲁兰酶逆向催化反应合成麦芽糖基-β-环糊精的工艺进行了优化,并对合成产物结构进行了表征,同时对麦芽糖基-β-环糊精的应用进行了初步研究。 确定了麦芽糖基-β-环糊精的高效液相法和纸层析法检测条件。高效液相法定量检测的检测条件为:Hypersil NH_2柱ф4.6×250mm,K-2301示差折光检测器,流动相乙睛-水(60:40),流速1 mL/min,柱温30℃,进样量10μL。纸层析法用于样品中麦芽糖基-β-环糊精的定量定性检测的检测条件为:下行法层析,展开剂为正丙醇-正丁醇-水(5:3:4),展开时间12小时;以0.1 mol/L的HCL溶液作为洗脱剂,样品的含量在150-250μg之间。定性检测时干燥后直接显色即可。纸层析法准确性和重复性都较好,可以和HPLC互相配合,作为麦芽糖基-β-环糊精在生产和应用中的一种经济可靠的常规检测方法。 对普鲁兰酶进行了分离纯化,并进行了化学修饰。商品普鲁兰酶液,通过硫酸铵分级盐析,AKTA系统凝胶柱HiPrep 26/10 Desalting脱盐、Mono Q 10/100 GL柱上的离子交换层析、Superdex~(Tm) 200 10/300柱和HiPrep Sephacryl S-200HR凝胶色谱,分离得到了普鲁兰酶。SDS-PAGE电泳分析呈现单一条带,这表明该酶已经达到了电泳纯,该酶的分子量约为82 kDa。用DIC(丁二酮)、PMSF(苯甲磺酰氟)、DTT(二硫苏糖醇)、NBS(N-溴代琥珀酰亚胺)、DEPC(焦碳酸二乙酯)、EDC(碳二亚胺)、Ch-T(氯氨-T)和TNBS(三硝基苯磺酸)等八种专一性氨基酸残基修饰剂修饰纯化得到的普鲁兰酶后,结果表明精氨酸、氨基酸的羟基和巯基与酶活力无关,而色氨酸残基、组氨酸中的咪唑基、氨基酸的羧基、甲硫氨酸残基和赖氨酸ε-NH_2与普鲁兰酶活性有关,可能是酶活力的必需基团。 通过单因素实验和响应面法优化了麦芽糖基-β-环糊精制备条件。通过优化,麦芽糖基-β-环糊精生产的最适反应条件:温度,60℃,pH值4.5,麦芽糖和β-环状糊精摩尔比为12:1,底物浓度80%,加酶量200 U/gβ-环糊精,反应时间60 h。在此条件下,反应体系的麦芽糖基-β-环糊精浓度达到71 mg/mL,β-环糊精合成麦芽糖基-β-环糊精的转化率达到65%。 阐述了反向合成麦芽糖基-β-环糊精的可行性。应用计算化学手段,用AM1方法优化了生成麦芽糖基-β-环糊精过程中各分子的构型,得到了各分子的能量及反应的热效应。从能量结果看,生成麦芽糖基-β-环糊精的反应是吸热反应,吸收热量为294.7 kJ/mol。升高温度,平衡向正反应方向移动,且反应速度加快,有利于麦芽糖基-β-环糊精的生成,与实验结果一致。对于接枝多个麦芽糖基(两个或三个以上)生成如(G_2)_2-β-CD、(G_2)_3-β-CD等麦芽糖基-β-环糊精的反应,升高温度时,反应不利于合成接枝共聚物,且这种逆反应速度加快。 通过串联质谱、富立叶变换红外光谱仪、核磁共振波谱仪等仪器对合成的产物进行结构鉴定,表明产物结构为一个麦芽糖基通过α(1-6)键连接到了β-环糊精母体上;将麦芽糖基-β-环糊精用糖化酶水解,得到的产物通过串联质谱、富立叶变换红外光谱仪、核磁共振波谱仪等手段进行结构解析,发现糖化酶水解后的产物是葡萄糖基-β-环糊精(Glu-β-CD),进一步说明合成产物为麦芽糖基-β-环糊精。 利用DSC法对麦芽糖基-β-环糊精的热力学行为进行研究,按Kissinger方程和Ozawa方程对活化能等参数进行了计算。结果表明,麦芽糖基-β-环糊精的开始分解温度是328.7℃,Kissinger方程以及Ozawa方程计算出的麦芽糖基-β-环糊精的热分解活化能分别为41.44 kJ /mol和44 kJ /mol。根据Ozawa方法获得指前因子A为1.85×10~3 min~(-1),通过DSC曲线图,可以获得焓变(△H)为23.70 kJ /mol,以及熵变(△S)为0.0394 kJ /mol·K,降解速度常数k为0.228 min~(-1),同时麦芽糖基-β-环糊精的半衰期为3.04 min,玻璃化转变温度Tg是173℃。 研究了Mal-β-CD对黑胡椒精油的包合作用。首先运用GC-MS对黑胡椒精油的基本成分组成进行分析,β-石竹烯占黑胡椒精油挥发性组分的37.11%;其次研究了Mal-β-CD存在下,β-石竹烯的相溶解度曲线,建立了Mal-β-CD—β-石竹烯的定量分析方法;然后以包埋率为指标,运用正交设计优化了包合物的制备工艺;通过红外光谱及热重分析,确认了Mal-β-CD—β-石竹烯包合物的形成,热重分析表明β-石竹烯经Mal-β-CD包埋后,耐热性显著提高;黑胡椒精油的Mal-β-CD包合物在稳定性试验中呈现出较高的稳定性,产物完全溶于水,可显著提高黑胡椒精油的溶解度,包合物产物的临界湿度为67%。


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