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4α糖基转移酶环化活性定向控制及其大环糊精产物的分离及应用研究

王金鹏  
【摘要】:4α糖基转移酶(4αGtase)能够作用淀粉产生大环糊精(LR-CD),然而不同菌株来源的4αGtase作用淀粉产生的LR-CD的产率及聚合度范围有较大差异。本文采用生物信息学方法对4αGtase的结构及基本性质进行研究;建立了4αGtase酶活测定新方法;探讨了影响定向环化反应的因素;实现了高效酶法制备LR-CD,对制备得到的LR-CD进行了毛细管电泳分离及鉴定,最后对LR-CD包合性能方面进行了研究。 构建了含有4αGtase基因的基因工程菌。核苷酸序列比对分析表明,重组蛋白的核苷酸序列与来自Thermus aquaticus的麦芽糖基转移酶的核苷酸序列相似程度高达98%;Clustal软件对氨基酸序列进行多序列比对分析表明,决定产物专一性的氨基酸残基位于保守性较差的、与底物发生结合的区域;结构分析PDB数据库预测显示4αGtase催化部位活性氨基酸为Asp293、Glu340、Asp395,且维持4αGtase三级结构的作用力中不存在二硫键;经SDS-PAGE测定4αGtase的相对分子质量为57000,与NCBI数据库根据氨基酸序列计算得到的分子量(56973 Da)基本一致;采用HPLC对4αGtase作用麦芽低聚糖后产物进行分析,结果表明4αGtase具有良好的转糖基活性,且最小作用单位是麦芽糖。 建立了4αGtase酶活测定新方法。首次将三波长分光光度法(TWC)和正交函数分光光度法(OFS)用于混合物中LR-CD含量及直链淀粉含量的测定,并与常用的单波长分光光度法(SWC)进行对比,结果表明,SWC、TWC、OFS三种方法的标准方差均小于2%,其精密度均能满足实验要求。在测定混合物中直链淀粉含量时,OFS的回收率达到87%-106%,显著优于SWC(109%-145%)及TWC(0-106%);在测定混合物中LR-CD的含量时,TWC的回收率为94%-104%,显著优于SWC(132%-483%)及OFS(87%-106%)。TWC适于测定4αGtase环化活性,OFS适于测定4αGtase总酶活。经测定得到4αGtase粗酶的环化活性为26 U/μl,总酶活为342 U/μl;4αGtase纯酶的环化活性为73 U/μl,总酶活为243 U/μl。 研究了影响4αGtase定向环化反应的因素。4αGtase环化反应的速率常数为21.85 mmol/mL,最大反应速率为0.9906 mg/mL/min;总反应的速率常数为2.92 mmol/μl,最大反应速率为546.78 mg/mL/min;环化活性最大时的反应pH为9.0、温度为70℃,总酶活最大时的反应pH为7.5、温度为80℃;荧光光谱及圆二色谱分析表明,DMSO、麦芽糖、乙醇、金属离子等添加物改变了4αGtase周围环境的极性及4αGtase的构象,从而影响4αGtase活性;以LR-CD得率为响应值,采用Plackett-Burman设计对玉米淀粉含量、加酶量、缓冲盐浓度、乙醇添加量、温度、时间、pH、DMSO含量等8个因素进行了筛选试验,研究结果表明加酶量、温度、时间对LR-CD得率有显著性影响;采用Box–Behnken设计对三个显著因素进行优化,结果表明:在加酶量91.34 U/mL、反应温度71.7℃、反应时间6.8 h的条件下,LR-CD产率达到55%,较优化前提高了2.3倍。 建立了LR-CD快速分离新方法。首次采用碘亲和毛细管电泳实现聚合度范围为20-40单一聚合度LR-CD的分离,分离采用的电泳缓冲体系的组成为:0.6 mM的I2、3.6 mM KI、80 mM磷酸缓冲液、pH为5.10;优化了毛细管电泳的最佳分离条件:分离电压为10 kV,分离温度为20℃;在此分离条件下对制备得到LR-CD样品进行毛细管电泳分离,并采用分子排阻色谱、TOF-MS及复合酶法对LR-CD样品进行鉴定,结果表明,制备所得LR-CD的聚合度范围为20-40,重均分子量为3 733 Da,α-1,4-糖苷键连接的环状比例为47%。 研究了LR-CD的包合性能。以共轭四烯类大环内酯抗生素制霉菌素为客体,探讨了不同空腔大小环糊精对制霉菌素的包埋能力,β-环糊精(β-CD)、γ-环糊精(γ-CD)以及LR-CD的相溶解曲线为AL型,α-环糊精(α-CD)的相溶解曲线为BS型;计算得到β-CD包埋制霉菌素的包合常数为0.375 l/mmol,γ-CD包埋制霉菌素的包合常数为0.539 l/mmol,LR-CD包埋制霉菌素的包合常数为1.577 l/mmol;预测饱和环糊精溶液对制霉菌素的增溶倍数分别为:β-CD为6.21;γ-CD为103.39;LR-CD为2958.87;经红外光谱鉴定,推测制霉菌素的酯键及二烯部分进入到环糊精的空腔,而共轭四烯部分及羧基、氨基部分在环糊精腔体表面,两者主要通过疏水作用及氢键相互作用形成稳定的复合物;分子模拟验证了这一推测,LR-CD扭曲的空间结构容易和大分子客体之间形成空间分子笼,从而增加其包埋能力及包埋稳定性;稳定性试验表明,经包合的制霉菌素粉末的储藏稳定性及温度稳定性得到提高。


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