收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Serratia marcescens SYBC 08的筛选、鉴定及其发酵产过氧化氢酶的研究

曾化伟  
【摘要】:过氧化氢酶(Catalase, CAT)通过催化一对电子的转移最终将H_2O_2分解为H2O和O2。其广泛应用于食品、纺织、造纸、环保等行业。因此,研究微生物发酵生产CAT具有一定的理论价值和潜在的应用前景。 论文研究了产CAT菌株的筛选,经透射电镜观察、脂肪酸等生理生化观测和16S rRNA基因序列分析鉴定了一株高产CAT的细菌。考察了其发酵产酶条件,研究了发酵产酶调控方法、产酶生理、进行了酶的纯化与性质研究,克隆了该酶基因并进行了序列分析,取得了如下主要结果: 分别采用H_2O_2富集生长法和H_2O_2起泡检测法,从37份土壤和污泥样品中,共筛选获得141株潜在的CAT高产菌。用H_2O_2起泡检测法从纺织厂漂洗车间含H_2O_2污泥中筛选获得一株CAT产量最高的菌株。在LB培养基平板培养48 h后,菌落为紫红色、圆形、光滑、湿润,表面隆起呈金属光泽,边缘整齐或不整齐,有轻微异味,色素不扩散到培养基中。该菌株有丙酮酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶,无精氨酸双水解酶。菌株能利用蔗糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、山梨醇,但不能利用L-鼠李糖、纤维二糖、蜜二糖。经透射电镜观察,这株菌能产圆形或棒形芽孢。主要的脂肪酸含量为C17:0 CYCLO (17.3 %),C_(16:0) (14.8 %),C_(10:0)3OH (10.0 %),C_(17:0) CYCLO (17.3 %),C_(14:0) (6.0 %)。经16S rRNA基因序列鉴定,将菌株命名为粘质沙雷菌(Serratia marcescens SYBC08)。研究还发现该菌株在碳源利用、主要脂肪酸含量等生理生化特征和其它的粘质沙雷菌有差异。该菌株CAT比活力较高,是生长于无H_2O_2环境S. marcescens SYBC-01的10.6倍。高的CAT比活力和产芽孢可能是其能够生长在H_2O_2胁迫环境的机制。通过对硫酸铵沉淀得到了粗CAT,进行主要应用酶学性质的研究表明,初步纯化的CAT在高温强碱和低温条件有一定的应用潜力。 研究了S. marcescens SYBC08摇瓶发酵产CAT的最佳条件。以合成NADH主要途径TCA循环的中间产物柠檬酸为碳源发酵产CAT,较其它碳源提高了产量。推测CAT产量的提高与NADH的合成有密切的关系。再经响应面方法对发酵条件进一步优化。优化后的发酵条件:柠檬酸30 g/L、玉米浆33.8 g/L、初始pH 5.91、接种量4 % (v/v)、装液量50 mL/250 mL、转速250 r/min、温度32.8℃、培养36 h。酶产量从1470 U/mL提高到12165 U/mL,提高了7.27倍。 在5 L小型发酵罐下,以摇瓶发酵的最佳培养基为发酵罐条件下的发酵培养基,研究了S. marcescens SYBC08产CAT的分批发酵条件。最佳的培养条件:通气量1.5 vvm、pH 7.0、转速400 r/min、相对溶氧控制在5 %、发酵时间22 h。在此条件下,CAT最高产量为22422 U/mL。进一步添加100 mg/L的烟酸以调控NADH的合成,CAT产量提高了15.1 %,达到26442 U/mL。 分别以葡萄糖和柠檬酸为发酵碳源,研究了S. marcesces SYBC08产CAT过程的生理特征,分析了柠檬酸促进CAT产量的机制。CAT产量提高的过程中,AhpC活力及胞内VC含量提高较明显,MDA含量下降明显。发现两种碳源发酵的CAT产量均与抗氧化指标有显著或极显著的相关性,说明CAT产量的提高与氧化胁迫有关,柠檬酸为发酵碳源较葡萄糖为发酵碳源有更高的CAT产量,是增强了氧化胁迫。 S. marcescens SYBC08的粗酶液经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化得到纯的CAT。该过程的纯化倍数为13.8,回收率为22 %。CAT的分子量为230 kDa,由4个分子量为58 kDa同源亚基组成。该酶的比活力(199584 U/mg蛋白)是Halomonas sp. Sk1的3.44倍。该酶在405 nm和280 nm有吸收峰,A405/A280比值为0.42。K_m和V_(max)分别为78 mmol/L和188212 U/mg。1.0 mmol/L的Mg~(2+)和Ca~(2+)对CAT活力有显著的激活作用,Mn~(2+)、EDTA和邻苯二酚对CAT活力有显著的抑制作用。CAT有较宽的pH最佳活力(pH 7.0-9.0)和pH稳定性范围(pH 5.0-11.0)。最适的温度大约为20℃,在0℃依然有78.5 %的活力,这个结果证明其为常温菌产的低温单功能CAT。经LC-MS/MS氨基酸序列分析,该酶与S. proteamaculans 568的CAT氨基酸序列(gi|157371515 )最为匹配。由S. proteamaculans 568 CAT的基因序列设计引物并获得该CAT基因。该酶基因长度为1437 bp,Genbank上的登录号为HM068611。经该基因推导的氨基酸序列与相关的23个CAT比对并构建系统进化树。结果表明,虽然大部分具有重要功能的位点在24个相关的CAT中是相当保守,S. marcescens SYBC08 CAT推导的氨基酸序列残基(M53、S93、H341、H284和F194)在相关CAT中并不完全保守,说明不同CAT之间的催化行为有一定的多样性。该高比活CAT在肠杆菌科中具有最高的相似性,说明一些肠杆菌科微生物中的该类酶在抵御H_2O_2对细胞的伤害中发挥了重要的生理功能。该基因推导的氨基酸序列预测的二级、三级结构表明,二级结构中含的螺旋结构、折叠片状结构、环形及其它结构含量分别为27.8 %、16.7 %和55.4 %,预测的NORS区在343-423。预测的酶亚基三维结构与已知的1e93A(2.00 ?)有85.169 %的相似度。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王福荣,唐景春;耐高温α-淀粉酶活力测定法的研究[J];食品与发酵工业;1995年02期
2 曹立民,何国庆;啤酒用小麦发芽期间三种胚乳降解酶的研究[J];中国粮油学报;2002年05期
3 姜德生,龙胜亚,肖海燕,周菊英,黄俊;磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体[J];应用化学;2005年10期
4 李冰;邵海员;黎锡流;李琳;刘国琴;浦帅骅;;磁性固定化纤维素酶的交联法制备及其磁致酶学性质[J];河南工业大学学报(自然科学版);2006年06期
5 蔡勇;阿依木古丽;;碱性纤维素酶高产菌株Bacillus sp.CY1-3的诱变选育[J];西北民族大学学报(自然科学版);2007年02期
6 李爽;董润安;贺玉明;;芽孢杆菌所产果胶裂解酶检测条件的研究[J];生命科学仪器;2007年09期
7 吴京平;;几种促进因子对中性蛋白酶活力影响比较[J];食品科技;2008年06期
8 吴京平;;两种天然有机物对碱性蛋白酶活力和热稳定性的影响[J];中国皮革;2008年09期
9 杨明;董超;史延茂;张丽萍;李楠;;纤维蛋白平板法测定纳豆激酶方法的改进[J];中国酿造;2008年07期
10 屈宁;韩宝芹;刘万顺;解卉;;混合发酵产甲壳素酶发酵条件优化及粗酶部分性质研究[J];海洋科学;2008年10期
11 张振乾;官春云;;可催化生产生物柴油脂肪酶产生菌的筛选及其培养条件研究[J];中国油脂;2009年01期
12 张丽萍;王莹;崔素萍;;酸法提取猪胃蛋白酶的工艺研究[J];食品科学;2009年10期
13 刘春叶;张剑;许旭;;毛细管电泳激光诱导荧光法检测多酶片中四种生物酶[J];应用化工;2009年05期
14 尚伟龙;刘伟;王龙波;;陶瓷-壳聚糖复合材料固定真菌漆酶[J];北京化工大学学报(自然科学版);2009年04期
15 宋慧;马利华;秦卫东;郑思泉;;复合酶法提取牛蒡多糖[J];粮油加工;2009年08期
16 李红然;贺淹才;刘治江;刘杨斐;;产几丁质酶菌株的分离与鉴定及产酶条件优化[J];华侨大学学报(自然科学版);2009年05期
17 杨秋明;肖安风;杨远帆;蔡慧农;;米曲霉的定向发酵[J];重庆理工大学学报(自然科学版);2011年02期
18 陈燕;王小芬;金伟;胡申才;曾驰;;产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定[J];武汉工业学院学报;2011年03期
19 ;几种工业用酶的若干性能[J];中国皮革;1973年03期
20 张立武;徐僖;;固定化酶技术进展Ⅰ.固定化方法[J];四川大学学报(工程科学版);1989年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 ;利用放射能保藏粮谷对蛋白質营养价值的影响(以肝脏黃嘌呤氧化酶活力为判定指标)[A];中国生理科学会第二届全国营养专业学术会议论文摘要汇编[C];1979年
2 齐金峰;熊华;张明丽;陈升军;李亮;李庭;黄军;;乳酸克鲁维酵母乳糖酶性质的研究[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年
3 张茜;康劲翮;陈清西;石艳;;金属离子和修饰剂对葡萄糖氧化酶活力的影响[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
4 熊郃;干信;;β-甘露聚糖酶产生菌R_(10)的产酶特性研究[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年
5 冒高伟;冯定远;董泽敏;曹庆云;叶慧;;不同理化条件对α-半乳糖苷酶活性的影响[A];动物营养与饲料研究——第五届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2006年
6 赵德英;茌亚青;陆书凯;;饲用糖化酶固体发酵条件研究[A];济宁市技术创新与可持续发展论文选编[C];2005年
7 林性玉;陳詩書;邵國英;潘碧霞;孫月霞;張惠珠;;不同肝機能狀態時激素對大鼠肝中某些酶活力的影響 Ⅰ.皮質素對CCl_4中毒肝及再生肝中色氨酸吡咯酶活力的影響[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
8 侯炳炎;;木聚糖酶的研究和工业生产及其在饲料中的应用[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年
9 张晓博;王兰;王茜;何永吉;;镉对河南华溪蟹线粒体酶的影响[A];中国动物学会北方七省市动物学会学术研讨会论文集[C];2005年
10 王宏亮;高世勇;季宇彬;;龙葵总碱对肿瘤细胞膜钠泵及钙泵活性影响的研究[A];第八届全国中药和天然药物学术研讨会与第五届全国药用植物和植物药学学术研讨会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李志华;卡马西平对虹鳟的生态毒理学影响[D];西南大学;2013年
2 王广利;青杨脊虎天牛信息化学物质的研究[D];东北林业大学;2009年
3 邓彩萍;光肩星天牛刻槽微生物及其对幼虫致病性的研究[D];北京林业大学;2009年
4 张艳芳;多菌株制曲促进酶系优化与提高酱油质量的研究[D];江南大学;2009年
5 熊冬梅;黑斑原鮡消化生理的研究[D];华中农业大学;2010年
6 刘宏;猪肺血管紧张素转换酶性质及相关抑制剂的研究[D];中国协和医科大学;2000年
7 宋鹏;微生物发酵降低卷烟烟气中有害成分及提高卷烟质量的研究[D];西北大学;2008年
8 吴嘉炜;酶的调控机制及动力学[D];中国科学院研究生院(生物物理研究所);1999年
9 石艳;菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质研究[D];厦门大学;2006年
10 薛超彬;菜青虫酚氧化酶抑制剂的抑制动力学及其构效关系(QSAR)研究[D];山东农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈蓓蕾;细胞型血小板活化因子乙酰水解酶Ⅱ酶活力及基因变异与脑血栓相关性研究[D];扬州大学;2005年
2 涂勇;新型诱导抗病剂—海藻氨基酸液肥的研究[D];四川农业大学;2005年
3 王彦美;杀虫剂对鱼生理活性的影响[D];山东师范大学;2008年
4 张锦芳;D-核糖生产菌株的选育——D-葡萄糖脱氢酶与D-核糖产量关系的研究[D];天津轻工业学院;2000年
5 潘江球;影响菠萝蛋白酶活力主要因素的研究[D];华南热带农业大学;2003年
6 姜令绪;环境因子对甲壳动物免疫力和抗氧化酶活力的影响[D];中国海洋大学;2004年
7 赵玮莉;Co~(60)γ射线诱变选育木聚糖酶和β-葡聚糖酶高产菌株及其应用研究[D];河南农业大学;2005年
8 李依韦;睾丸酮丛生假单胞杆菌甾醇降解酶活力研究[D];福建农林大学;2005年
9 陈文祥;产纤维素酶放线菌的筛选及其产酶条件与酶学性质初探[D];四川师范大学;2007年
10 关志炜;枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的研究[D];山东轻工业学院;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李佳庆;诺维信推出酶活力定性检测方法[N];中国化工报;2002年
2 尹卿建 陈铁;天冠高转化率糖化酶技术降成本[N];中国化工报;2006年
3 郭凤莲 陈存社;微生物制备复合酶制剂研究进展[N];中国食品质量报;2009年
4 陈芳;小儿腹泻需停母乳[N];农村医药报(汉);2007年
5 唐伟;玉米芯酶法制备低聚木糖[N];科技日报;2007年
6 石磊;天冠高转化率糖化酶技术降成本[N];医药经济报;2006年
7 国际注册高级营养师 龙日荣;酸性体液是怎么样危害身体的?[N];广东科技报;2006年
8 蒋家騉;为什么酸味食品不是呈酸性食品[N];家庭医生报;2007年
9 福建省农业科学院 谢新东;饲用酶制剂生产及应用中应注意啥[N];中国畜牧报;2004年
10 福建省农业科学院 谢新东;饲用酶制剂生产及应用中应注意啥[N];中国畜牧报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978