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L-色氨酸生产菌株的构建及代谢调控研究

赵志军  
【摘要】:L-色氨酸(L-tryptophan, L-Trp)作为人体内的一种必需氨基酸,广泛应用于医药、食品、饲料等行业。而微生物发酵法生产L-Trp由于具有原料廉价、产物纯度高、易提取等优点受到了越来越多的关注。近年来,国外通过代谢工程的手段,逐渐培育出一批高产的L-Trp生产菌株,但其在发酵过程中仍存在发酵后期L-Trp生产速率下降明显,副产物积累等问题,此外,上述工程菌的构建过程均涉及多轮的化学诱变,很难确认诱变过程中次级突变对菌株的影响,进而阻碍了菌种的进一步改良。而在国内,利用代谢工程手段选育L-Trp生产菌株的研究在2000年以后才逐渐得到展开,已构建菌株的L-Trp生产能力与国外同类菌株相比差距较大,直接限制了我国L-Trp生产行业的快速发展。 针对以上国内外的研究现状,本论文运用代谢工程的研究策略,以E. coli W3110为出发菌株,在不涉及化学诱变的情况下,通过一系列的基因操作构建L-Trp的生产菌株,同时通过直接测定菌株20余种胞内代谢产物的浓度,分析了L-Trp合成代谢的流量分布特征,为进一步菌种改良提供了依据。主要的研究内容及结果如下: (1)通过定点突变删除3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶AroF第11位氨基酸残基Ile11,获得抗反馈抑制突变体AroF~(fbr);通过置换邻氨基苯甲酸(ANTA)合酶第40位氨基酸残基Ser40为Phe,获得抗反馈抑制突变体TrpE~(fbr)D;利用Red重组技术,通过敲除E. coli W3110基因组上的trpR基因,解除了TrpR蛋白对trp操纵子转录的反馈阻遏调控;将基因aroF~(fbr)和trpE~(fbr)D克隆至低拷贝、具有PR、PL双启动子的原核表达载体pSV中,构建重组质粒pSV04,并转化至trpR敲除菌,获得工程菌FB-01/pSV04。发酵结果表明,发酵30 h,L-Trp产量为2.8 g/L,同时发酵液中有副产物积累,分别为:L-Phe 1.8 g/L,L-Tyr 1.4 g/L和ANTA 2.3 g/L。 (2)在基因trpR敲除的基础上,通过敲除tnaA基因,切断菌体内的L-Trp分解途径,构建trpR.tnaA双基因敲除菌FB-02,获得工程菌FB-02/pSV04,发酵结果表明L-Trp产量大幅上升至7.8 g/L,但同时积累了较多的副产物,分别为L-Phe 5.3 g/L,L-Tyr 3.6 g/L,ANTA 5.4 g/L;为了阻止副产物L-Phe的积累,在菌株FB-02的基因组上敲除L-Phe分支途径的关键酶基因pheA,构建trpR.tnaA.pheA多基因敲除菌FB-03,工程菌FB-03/pSV04的发酵结果表明,发酵液中L-Phe积累量不足1 g/L,达到预期目的,但同时L-Tyr的积累量上升至5.1 g/L,而L-Trp产量提高至10.8 g/L;在菌株FB-03的基因组中进一步敲除L-Tyr分支途径中的关键酶基因tyrA,构建trpR.tnaA.pheA.tyrA多基因敲除菌FB-04,获得工程菌FB-04/pSV04;在基因pheA和tyrA均被敲除以后,需要在培养基中添加适量的L-Phe(2 g/L)和L-Tyr(3 g/L),菌体FB-04/pSV04才能正常发酵,发酵结果表明L-Trp产量上升至13.3 g/L,而副产物ANTA的积累量在pheA和tyrA基因敲除前后基本没有变化。 (3)以菌株FB-03为出发菌株,分别构建L-Trp吸收系统调控基因mtr、tnaB和aroP的缺失突变菌FB-T1、FB-T2和FB-T3;L-Trp吸收活性的测定分析表明,mtr、tnaB和aroP三个基因敲除菌的L-Trp吸收活性与对照菌FB-03相比,分别降低了48%、34%和17%;将重组质粒pSV04转化至上述三个突变菌株中,发酵结果表明,mtr、tnaB和aroP三个敲除菌的L-Trp产量分别为14.7、13.1、和12.3 g/L,与对照菌FB-03/pSV04相比分别提高了34%,19%和12%;此外,吸收基因mtr、tnaB和aroP的敲除,还有利于减少副产物的积累,其中, L-Tyr的积累量与对照菌相比,分别下降了40%、21%、15%; ANTA的积累量与对照菌相比,分别下降了25%、11%、6%;通过测定mtr敲除菌FB-T1/pSV04胞内的L-Trp浓度,发现在发酵过程中,mtr敲除菌胞内L-Trp浓度的增长速率远小于对照菌FB-03/pSV04,在发酵中期的16 h和24 h,mtr敲除菌的胞内L-Trp浓度分别为27.4和50.9μmol/L,与对照菌相比分别下降了42%和35%,由此探讨了L-Trp吸收系统基因敲除促进L-Trp生产的作用机理。 (4)在大肠杆菌里,trp操纵子结构基因trpEDCBA的转录受到操纵子内部前导肽trpL中的一段衰减子序列的调控,利用RNA structure软件对前导肽trpL序列的RNA二级结构进行预测分析,表明在利用Red重组系统敲除trpL内部的10-118位核苷酸序列后, trpL的RNA二级结构自由能下降了32%,但trpL 10-118位序列敲除菌FB-L1/pSV04的发酵结果表明,在trpL 10-118位序列敲除前后,L-Trp的产量以及副产物的积累量均没有明显变化,分析原因可能是相对于借助重组质粒pSV04增强trpED的表达量而言,通过削弱衰减子对结构基因trpEDCBA的转录调控,增加结构基因表达量的作用有限;利用DNAMAN软件对结构基因trpEDCBA内部的限制性酶切位点进行分析,选择Eag I、Sca I和Hpa I三个酶切位点将基因trpDCBA分割成trpD*C*、trpC*B*和trpB*A(“*”表示为相应基因的部分序列)三个DNA片段,并按先后次序将其克隆至重组质粒pSV04中,完成结构基因trpE~(fbr)DCBA的克隆,获得重组质粒pSV05;对工程菌FB-T1/pSV05进行发酵,结果表明,L-Trp产量为17.7 g/L,与菌株FB-T1/pSV04相比提高了21%,葡萄糖转化率为0.13;同时发酵液中ANTA的积累量为1.9 g/L,与菌株FB-T1/pSV04相比下降了51%。 (5)将菌株E.coli FB-02/pSV04、FB-03/pSV04和FB-T1/pSV04分别发酵培养至稳定期中期,借助三重四级杆串联质谱仪LC-MS-MS分别测定三个菌株胞内20余种代谢产物的浓度,同时通过RP-HPLC测定三个菌株主要胞外代谢产物L-Trp、L-Phe、L-Tyr和ANTA在发酵液中的浓度;根据KEGG网站(http://www.genome.jp/kegg/)上的微生物代谢网络信息绘制大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-Trp的代谢网络图谱,根据测定的胞内代谢物浓度,计算三个菌株L-Trp合成代谢的流量分布,并在此基础上分别对菌体的葡萄糖吸收速率、主途径碳流量和关键中间产物的碳流量进行分析,确定提高前体物E4P和L-Ser的合成量,是菌株FB-T1/pSV05进一步改良的重点。


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