收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Streptomyces sp.M-Z18发酵生产ε-聚赖氨酸的碳源供给策略与过程调控研究

陈旭升  
【摘要】:ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是微生物通过非核糖体合成方式催化25~35个L-赖氨酸单体,以α-COOH和ε-NH_2相互缩合的方式而形成的一种同型L-赖氨酸链状聚合物,分子量一般为2500~4500 Da。由于其具有抑菌性广、水溶性强、热稳定性好、pH值使用范围广以及安全性高等优点,目前主要作为食品防腐剂应用在食品防腐和保鲜领域,已经在日本形成数十亿日元市场。同时,作为一种阳离子型生物聚合物,ε-PL还广泛应用于生物材料和药物载体研究。因此,研究开发ε-PL发酵技术以提高ε-PL发酵水平,实现低成本、高效率ε-PL发酵生产,为我国建立ε-PL产业提供技术支撑。 本论文利用一株ε-PL高产菌Streptomyces sp. M-Z18,提出了工业甘油、甘油和葡萄糖混合物、前体L-赖氨酸作为发酵底物的供给策略,通过发酵过程优化与调控技术,显著提高了ε-PL发酵水平;考察了甘油和葡萄糖作碳源引起ε-PL合成的差异;研究了Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-PL的机制;建立了转化前体L-赖氨酸耦合发酵生产ε-PL的工艺。具体研究内容如下: (1)在确定工业甘油作为发酵碳源的前提下,筛选出相匹配的牛肉浸膏、(NH4)2SO_4、KH_2PO_4、K_2HPO_4、MgSO_4·7H_2O和FeSO_4·7H_2O作为Streptomyces sp. M-Z18合成ε-PL的营养成分;借助Plackett-Burman设计确定了甘油、硫酸铵和K_2HPO_4是影响ε-PL合成的关键营养成分;利用响应面分析构建出最优营养组合为:甘油60 g/L,(NH4)2SO_4 5 g/L,牛肉浸膏10 g/L,KH_2PO_4 4 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.8 g/L,FeSO_4·7H_2O 0.05 g/L。利用该优化培养基自然发酵生产ε-PL(pH值不控制),摇瓶ε-PL产量达到2.27 g/L,菌体干重达到7.75 g/L;5 L发酵罐分批发酵ε-PL产量为3.5 g/L,是出发培养基(M3G培养基)的3倍。 (2)在研究pH值对ε-PL发酵过程影响的基础上,以最大ε-PL比合成速率为调控目标,建立了一种利用甘油为碳源的两阶段pH值控制策略发酵生产ε-PL工艺。该工艺使得ε-PL分批发酵产量和产率达到9.13 g/L和4.76 g/L/d,较最优单一pH值控制发酵(pH3.5)分别提高16.6%和52.1%。结合甘油和硫酸铵流加技术,ε-PL发酵产量达到30.11 g/L,ε-PL产率为4.18 g/L/d,转化率达到13.2%。根据葡萄糖和甘油发酵生产ε-PL的互补性优点,提出了甘油-葡萄糖双碳源发酵生产ε-PL工艺。研究发现,Streptomyces sp. M-Z18不仅能够同步消耗甘油和葡萄糖用于菌体生长和ε-PL合成,并且显著缩短了发酵时间,提高了ε-PL合成速率。当葡萄糖和甘油混合比例为30/30(w/w)时,发酵速率比任何单一碳源都显著提高:较葡萄糖快25.4%,较甘油快32.8%。甘油-葡萄糖双碳源(30/30,w/w)补料-分批发酵使得ε-PL发酵产量达到35.14 g/L,ε-PL产率为4.85 g/L/d,转化率为12.1%。 (3)在考察甘油和葡萄糖对Streptomyces sp. M-Z18合成ε-PL影响时,发现甘油和葡萄糖引起了ε-PL合成的显著差异。通过对两种碳源下ε-PL发酵过程关键酶活性变化考察,发现磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)在以葡萄糖为碳源的发酵过程中表现出较高活性,而天门冬氨酸激酶(ASPK)和ε-PL合成酶(Pls)在以甘油为碳源的发酵过程中活性较高;两种碳源下ε-PL发酵过程代谢通量分析表明:以甘油为碳源减小了杂氨基酸合成和菌体合成通量,增大了磷酸戊糖途径、TCA循环回补途径、天门冬氨酸族氨基酸合成途径和L-赖氨酸合成等途径的代谢流量,而TCA循环代谢通量基本保持不变,这说明甘油作碳源能够使得更多的碳代谢流流向ε-PL的合成途径,减少了代谢副产物的生成,提高了产物转化率;考察不同还原度碳源(葡萄糖酸、葡萄糖和山梨醇)对菌体生长和ε-PL合成影响,发现碳源还原度越接近前体L-赖氨酸还原度越有利于ε-PL合成。在上述实验结论的基础上,提出了甘油优于葡萄糖合成ε-PL的可能机制在于:①甘油作为小分子多元醇通过水取代机理稳定了酶的空间构象而提高了ε-PL合成途径中天门冬氨酸激酶和ε-PL合成酶活性,从而增大了ε-PL合成途径代谢通量,提高了ε-PL产量;②甘油与L-赖氨酸还原度相同,实现了底物和产物前体的氧化还原平衡,减少了代谢副产物生成,提高了产物转化率;③甘油比葡萄糖为ε-PL合成提供了更多的能量辅因子ATP。 (4)利用两阶段培养方法考察前体L-赖氨酸对ε-PL合成影响时,发现低浓度(1~2 g/L)L-赖氨酸能够显著促进ε-PL合成。利用同位素标记方法(L-(U-13C)赖氨酸)和核磁共振分析技术(NMR)研究L-赖氨酸转化机制时,发现L-赖氨酸是作为整体直接参与ε-PL合成,且细胞转化前体L-赖氨酸比例为40%左右,该比例不会随着前体L-赖氨酸浓度的增加而提高。在对甘油、pH值、L-赖氨酸和细胞膜通透性等因素的考察基础上,建立了Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-PL体系并强化了该转化过程。通过对转化过程的研究,发现转化体系合成ε-PL来源于两条途径:①转化外源L-赖氨酸合成ε-PL途径;②转化甘油形成内源L-赖氨酸合成ε-PL途径。 (5)在考察pH值对5 L发酵罐规模Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-PL过程影响的基础上,建立了5 L发酵罐规模补料-分批转化体系,使得ε-PL合成能力达到15 g/L。前体L-赖氨酸添加方式对ε-PL发酵过程影响研究结果表明,在发酵后期添加1 g/L L-赖氨酸有利于实现发酵与前体L-赖氨酸转化的同步进行。结合甘油单一碳源和甘油-葡萄糖双碳源发酵生产ε-PL工艺,初步建立转化前体L-赖氨酸耦合发酵生产ε-PL工艺。两种ε-PL生产工艺分别实现ε-PL发酵产量达到33.76 g/L和37.6 g/L。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 闵丽娥,刘克武,刘晓雯,张斌,喻东;几种维生素和碳源对红曲色素生成的影响[J];中国酿造;2000年06期
2 任健;李军;马文瑾;李佟;;酸化液对反硝化速率的影响研究[J];中国给水排水;2010年07期
3 黄理辉,马鲁铭,张波,毕学军;城市污水处理厂对高碳源废水的利用[J];环境保护;2003年11期
4 刘建福,王璋,许时婴;碳源对K.fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶合成的影响[J];工业微生物;2004年03期
5 林增祥;付永前;张军;曾宪贤;;阿魏菇GC-1菌株液体培养条件优化的研究[J];化学与生物工程;2006年03期
6 孙海放;曹建平;颜芳;;降低微生物絮凝剂M-25生产成本的研究[J];江西农业大学学报;2006年03期
7 甘晖;黄桂华;连锦明;;磷酸亚铁锂/碳的合成动力学研究[J];吉林化工学院学报;2007年02期
8 卜庆梅;韩立亚;黄清荣;杨圣勇;;黄伞胞外多糖液体培养基的优选[J];食品科学;2007年08期
9 赵林果;陆叶;谢惠芳;李治林;;碳源和氮源对彩绒革盖菌液体发酵合成漆酶的影响[J];微生物学杂志;2007年05期
10 张照韩;刘广民;温青;李凯峰;陈忠喜;;COD对反硝化抑制硫酸盐还原的影响[J];水处理技术;2007年11期
11 贾志华;张小里;曹学君;;碳源对土曲霉中洛伐他汀生物合成的影响[J];化学工程;2008年05期
12 黄启忠;刘立海;谢志勇;周乐平;谭瑞轩;郭俊;;碳源对微正压ICVI炭/炭复合材料的密度和结构的影响[J];中南大学学报(自然科学版);2008年06期
13 高卫卫;杜金华;韩伟;李荣芳;;产朊假丝酵母利用有机酸的研究[J];食品与发酵工业;2008年12期
14 魏宝东;王晓晨;林雨舒;;纳他霉素高产菌株发酵培养基优化[J];中国酿造;2009年06期
15 刘伟岩;李军;宋玮华;马文瑾;杨晓冬;何继文;李佟;;碳源对缺氧/厌氧/好氧工艺脱氮除磷效果的影响[J];中国给水排水;2009年13期
16 陈诚;何岩;高尚;黄民生;陶芳;;植物废料应用于白腐真菌处理难降解有机污染物[J];环境科学与技术;2009年12期
17 梅翔;占晶;沙昊;谢玥;朱瑾;;以红薯浸泡液为碳源的生物反硝化[J];环境工程学报;2010年05期
18 姚枝良;金彪;杜炯;;污水处理厂甲醇加药间设计探讨[J];给水排水;2010年05期
19 车晓曦;李社增;李校堃;;1株解淀粉芽孢杆菌发酵培养基的设计及发酵条件的优化[J];安徽农业科学;2010年18期
20 江勇;付梅臣;王增;张中亚;宋宝华;温洪艳;;土地利用变化对生态系统碳汇-碳源的影响研究——以河北武安市为例[J];安徽农业科学;2010年24期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 吴萍;李爱新;吴克宁;帅佳良;李芳颢;;区域碳源汇测算分析与模型拟合——以江西省为例[A];2010年中国土地学会学术年会论文集[C];2010年
2 王茂发;邹小平;程进;张红丹;任鹏飞;李飞;朱光;;催化燃烧法合成碳纳米线[A];第十届全国敏感元件与传感器学术会议论文集[C];2007年
3 丁伟;冷蕾;赵晨;黄芳;宋爱荣;;碳源对裂蹄木层孔菌菌丝体生长及其液体发酵的影响[A];中国菌物学会第四届会员代表大会暨全国第七届菌物学学术讨论会论文集[C];2008年
4 张伟;李娇妍;王红梅;刘玉文;;LiFePO_4/C复合正极材料中的新型碳源研究[A];中国化学会第27届学术年会第10分会场摘要集[C];2010年
5 万鲁长;单洪涛;黄春燕;张柏松;孙树凯;宇仁娥;;白灵侧耳菌丝生长对碳、氮营养需求的研究[A];首届海峡两岸食(药)用菌学术研讨会论文集[C];2005年
6 林辰壹;吴永霞;张娟;;巴音布鲁克草原雷蘑的碳氮营养源研究[A];2008园艺学进展(第八辑)——中国园艺学会第八届青年学术讨论会暨现代园艺论坛论文集[C];2008年
7 陈天虎;刘畅;王进;;以秸秆为缓释碳源的SRB处理AMD模拟研究[A];中国矿物岩石地球化学学会第12届学术年会论文集[C];2009年
8 苏宇;陈天虎;吕剑;王进;金杰;彭书传;;稻草为碳源硫酸盐还原菌处理强酸性矿山排水的实验研究[A];中国矿物岩石地球化学学会第12届学术年会论文集[C];2009年
9 魏昭;亢春雨;苏旭东;樊喜福;马小燕;李英军;张会彦;张伟;;防腐剂纳他霉素发酵工艺优化研究[A];2007中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨中国中部地区农产品加工产学研研讨会论文集[C];2007年
10 汪家权;王晓丽;潘哲;胡明明;;地下水N0_3~-污染微生物原位修复碳源的实验研究[A];地下水开发利用与污染防治技术专刊[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈旭升;Streptomyces sp.M-Z18发酵生产ε-聚赖氨酸的碳源供给策略与过程调控研究[D];江南大学;2011年
2 易维洁;碳源对水稻土中铁还原特征和铁还原菌多样性的影响[D];西北农林科技大学;2011年
3 张建美;地下水硝酸盐原位生物修复固相碳源及磷源性能研究[D];中国地质大学(北京);2012年
4 钱杰;大都市碳源碳汇研究——以上海市为例[D];华东师范大学;2004年
5 曹艳晓;剩余污泥作为低碳氮比生活污水补充碳源的脱氮试验研究[D];重庆大学;2010年
6 高磊;碳氮比调节在对虾养殖中的作用及优化[D];中国海洋大学;2012年
7 章宏梓;以餐饮废油为碳源的鼠李糖脂发酵及其应用研究[D];浙江大学;2010年
8 张晓萍;低聚糖和纤维类碳源对里氏木霉合成纤维素酶的诱导作用[D];南京林业大学;2010年
9 周军;两种类型反应器内好氧颗粒污泥性能研究[D];大连理工大学;2007年
10 佟娟;剩余污泥碱性发酵产生的短链脂肪酸作为生物脱氮除磷碳源的研究[D];同济大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨洋;崇明湿地碳源/汇监测和管理系统的设计和实现[D];华东师范大学;2011年
2 李观元;以丙酸为碳源的反硝化除磷工艺运行特性及影响因素研究[D];哈尔滨工业大学;2010年
3 杨勇光;碳源种类对反硝化除磷系统的影响及反硝化聚磷菌(DPB)的分离[D];重庆大学;2010年
4 林守祎;崇明湿地碳源汇信息共享发布系统设计与实现[D];华东师范大学;2011年
5 孙雅丽;沼液无土栽培氮污染控制实验研究[D];北京化工大学;2010年
6 李业英;碳源、氮源及其他条件对VB_(12)发酵影响的研究[D];河北大学;2004年
7 赵建;人工湿地对污染河水的净化效果及机理研究[D];河海大学;2006年
8 宋保平;产甘油假丝酵母生理生化特性、倍性及不同碳源发酵代谢的研究[D];江南大学;2012年
9 王利;三角紫叶酢浆草组培及碳源效应的研究[D];四川农业大学;2005年
10 赵翠翠;甲烷氧化菌代谢甲醇和乙醇的选择性研究[D];山西大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 施云海 房鼎业;CO2:二十一世纪的新碳源[N];中国化工报;2002年
2 记者 史芳 杨振威;建立以省为单位的“碳源-碳汇”交易制度[N];中国经济导报;2008年
3 李雪林;万元GDP净碳源量不断下降[N];文汇报;2007年
4 筱薇;如何开发碳源脱氮除磷?[N];中国环境报;2008年
5 苏 林;点“气”成“金”[N];大众科技报;2003年
6 华南理工大学食品学院 郑建仙;乳链球菌素发酵法生产的关键技术(上)[N];中国食品报;2008年
7 记者 李雪林;上海“碳天平”趋向平衡[N];文汇报;2008年
8 ;中国陆地生态系统仍是“吸碳功臣”[N];上海科技报;2008年
9 穆土;在科学发展观指导下大力推进节能减排[N];中国社会科学院院报;2007年
10 厦门大学 朱四海;低碳经济:怎么看 怎么办[N];中国电力报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978