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乳酸杆菌冷冻干燥生理损伤机制及保护策略的研究

李宝坤  
【摘要】:乳酸菌是一类重要的微生物,在食品工业上常常用作发酵剂及益生菌制品。冷冻干燥保藏是制备高效发酵剂常用的技术手段之一,但是冻干过程不可避免地会造成部分乳酸菌损伤,甚至死亡。多年以来,如何提高乳酸菌冷冻干燥后的活力,一直是乳酸菌冷冻干燥研究的重点。基于课题组相关研究,本论文以乳酸杆菌为研究对象,考察其冷冻干燥过程中的生理变化,探讨冷冻干燥对乳酸杆菌的生理损伤机制,采取相应减少生理损伤的保护策略,并对其保护机理进行深入研究。 以保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus),植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ),罗伊氏乳酸杆菌CICC6226(Lactobacillus reuteri CICC6226)为研究对象,评价其在不同保护剂中冷冻干燥后菌体存活率及活力,检测冻干后菌体糖代谢关键酶及细胞膜特性的变化,分析冷冻干燥造成菌体失活的主要因素,探讨冷冻干燥对乳酸杆菌的生理损伤机制。结果显示:添加保护剂可以显著提高乳酸菌的存活率和活力,但保护剂的效果存在一定的差异,对植物乳杆菌ST-Ⅲ来说,最佳的保护剂为10%的海藻糖,而对于罗伊氏乳酸杆菌与保加利亚乳杆菌来说,最佳的保护剂为10%的脱脂乳。分析其主要的代谢酶证实:冷冻干燥对己糖激酶、丙酮酸激酶影响不大,而对乳酸脱氢酶具有显著性的影响,说明乳酸脱氢酶失活是冷冻干燥损伤的主要因素之一。冷冻干燥致使乳酸菌细胞膜流动性降低,细胞膜通透性改变,胞内Ca~(2+)和蛋白流失,细胞膜完整性破坏,膜蛋白(ATP酶)功能受到损伤,从而影响了乳酸杆菌的正常生理代谢,这是冷冻干燥损伤的另一个重要因素。 以罗伊氏乳酸杆菌CICC6226(Lactobacillus reuteri CICC6226)为研究对象,采用胁迫处理保护策略,通过研究不同胁迫处理对乳酸菌存活率、活力、关键酶、膜通透性、流动性、完整性及脂肪酸比例的影响,探讨胁迫处理保护机制。研究证实:胁迫处理可以提高罗伊氏乳酸杆菌CICC6226存活率,经过4℃, 3h冷胁迫处理和经过45℃,30min热胁迫处理,分别比未处理组冷冻存活率提高了6.13%,7.46%,分别达到91.90%, 93.23%。同时,菌体的乳酸脱氢酶和ATP酶的活力损失较少,胞外β-半乳糖苷酶的含量较少,说明细胞通透性维持的较好,这一点在细胞膜的完整性检测中得到证实。冻干后菌体胞内离子浓度比例也发生了很大的变化,但是与菌体存活率之间的相关性不大,说明离子比例的变化,只能体现菌体细胞膜的损伤情况,表明细胞膜通透性的改变,而并非冷冻干燥过程中的主要致死原因。经过45℃,30min处理冷冻干燥菌体的荧光偏振度和微粘度最小,说明在此条件下,细胞膜流动性较好。利用气质联用测定了细胞膜脂肪酸组成变化情况,实验证实:在此胁迫处理条件下,冻干后菌体不饱和脂肪酸的比例上升,说明胁迫处理能诱导菌体合成不饱和脂肪酸,从而提高了对冷冻干燥的抗性。 以罗伊氏乳酸杆菌CICC6226 (Lactobacillus reuteri CICC6226)和植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)为研究对象,采用预培养保护策略,在优化预培养工艺条件的基础上,研究预培养对乳酸菌存活率、活力、关键酶、膜通透性、流动性、完整性的影响,探讨其保护机制。采用三因素二次通用旋转设计,建立了以海藻糖浓度,温度,时间对应存活率的数学模型,分别优化了罗伊氏乳酸杆菌CICC6226和植物乳杆菌ST-Ⅲ预培养冻干工艺,罗伊氏乳酸杆菌CICC6226最佳预培养冻干工艺为:海藻糖浓度11.45%,预培养温度38℃,预培养时间31.5min,在此条件下存活率为95.34±4.35%。植物乳杆菌ST-Ⅲ最佳预培养冻干工艺为:海藻糖浓度11.85%,预培养温度37.5℃,预培养时间为29min,在此条件下存活率为94.64±3.26%。研究证实:预培养有利于提高冻干后菌体活力,在预培养过程中LDH和ATP酶的活力得到恢复,预培养冻干前后菌体的细胞膜流动性变化不大,说明预培养有利于维持菌体细胞的流动性。 采用流式细胞的方法测定了冻干前、预培养前后冻干菌体的胞内pH、Ca~(2+)及细胞的完整性的变化,探讨预培养对膜通透性的影响,研究发现:经预培养,冻干后菌体胞内pH、Ca~(2+)变化比未经预培养的要小,说明预培养有利于维持细胞的通透性。同时,经过预培养冻干后,罗伊氏乳酸杆菌CICC6226和植物乳杆菌ST-Ⅲ的细胞膜完整性提高,说明预培养也有利于保持细胞膜的完整性,从而提高了冷冻干燥菌体的活力。 研究了不同贮藏温度对乳酸菌活力的影响,探讨了在不同贮藏温度下,其存活率,活力,乳酸脱氢酶及ATP酶的变化规律,研究发现:在4℃条件下,经过90天的贮藏,罗伊氏乳酸杆菌CICC6226和植物乳杆菌ST-Ⅲ分别保持了82.56%和82.38%的存活率。同时,在贮藏的过程中,随着贮藏温度的提高和时间的延长,两种菌体中的ATP酶和乳酸脱氢酶迅速失活,和贮藏期的菌体活力成正相关,说明菌体中关键酶的失活是导致菌体死亡的主要原因。


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