钝齿棒杆菌SYPA5-5发酵产L-精氨酸的代谢工程改造

【摘要】：钝齿棒杆菌SYPA 5-5是本实验室筛选并经过多级诱变获得的一株高产L-精氨酸生产用菌株。目前,代谢工程育种已在棒杆菌菌种改良方面得到了广泛的研究和应用。本文对钝齿棒杆菌进行了一系列代谢工程改造以进一步提高其L-精氨酸产量,并对L-精氨酸的合成代谢途径及调控机理进行了研究,主要结果如下: (1)克隆了钝齿棒杆菌SYPA 5-5精氨酸合成关键酶基因簇argCH 9039,将其中的8个基因(编码7个酶和1个阻遏蛋白)分别在大肠杆菌中进行了克隆表达;并对7个酶的酶学性质进行了初步研究,为进一步发酵过程优化提供了理论依据;另外,将7个酶逐个在SYPA 5-5中增强表达,获得的SYPA 5-5-argC~argH等重组钝齿棒杆菌发酵L-精氨酸的产量均有所提高,其摇瓶产酸提高率为9.3%~23.0%;同时,将携带上游启动子的argCH 9039基因簇在钝齿棒杆菌中过量表达,获得的重组菌SYPA 5-5-9039摇瓶产酸可提高40.9%;在5 L发酵罐上发酵产L-精氨酸达45.9 g/L,产酸提高了26.5%。 (2)通过对三株钝齿棒杆菌的argR基因进行序列同源比对分析,发现钝齿棒杆菌SYPA 5-5经多级诱变后argR基因在109 bp处发生了无义突变,导致其阻遏蛋白ArgR功能缺失。通过对钝齿棒杆菌ArgR阻遏型和缺失型菌株中7个酶的酶活力和产酸水平的差异分析证明了ArgR缺失型菌株的L-精氨酸合成效率明显高于ArgR阻遏型菌株;在辅阻遏物L-精氨酸的存在下对ArgR阻遏型和缺失型菌株的转录水平及蛋白表达差异进行分析;通过对钝齿棒杆菌全细胞蛋白差异图谱中的22个下调蛋白和7个上调蛋白进行质谱分析,发现ArgR阻遏蛋白与L-精氨酸的代谢密切相关,另外还与L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸等氨基酸的合成及TCA循环、磷酸戊糖途径(PPP)等相关。 (3)通过体外添加精氨酸考察了钝齿棒杆菌SYPA 5-5 L-精氨酸合成途径中的限速关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(Ccre_NAGK)的反馈抑制情况,测得Ccre_NAGK的抑制常数(I_(0.5)~R)仅为0.4 mM。在氨基酸同源性比对和三维结构建模基础上,共设计了16种突变型NAGK,包括5个N-端/C-端缺失型NAGK△2-15、△2-19、△2-29、▽8、▽25和11个单点突变型NAGKE_(19A、E19R、W23A、H26E、H268A、H268N、R209A、R209K、E281A、G287A、G287D)。确定在对其N-螺旋附近的E19,H26和H268点突变后I_(0.5)~R可提高50-60倍。在此基础上进行了联合多点突变,获得突变型NAGK36 (E19R+H26E+H268N),其I_(0.5)~R为784 mM,提高了1960倍,可达到解除钝齿棒杆菌胞内的L-精氨酸反馈抑制的目标;将突变型NAGK36 (E19R+H26E+H268N)在钝齿棒杆菌中过量表达,重组菌SYPA 5-5-CCB36 5 L发酵罐产酸45.6 g/L,比SYPA 5-5提高25.7%。 (4)利用二次同源重组分别将钝齿棒杆菌中L-脯氨酸、L-谷氨酰胺和L-赖氨酸合成途径关键酶编码基因proB、glnA和lysC进行了部分缺失敲除实验。分别构建了重组菌△proB、△glnA、△lysC,并对其进行产酸发酵分析。结果表明:glnA和lysC基因功能缺失,分别阻断了钝齿棒杆菌L-谷氨酰胺和L-赖氨酸的合成,但L-精氨酸的合成能力也随之显著降低;而proB基因的缺失,阻断了L-谷氨酸→L-脯氨酸的合成代谢流,使得L-谷氨酸→L-精氨酸合成分支代谢流量加强,重组菌SYPA 5-5△proB摇瓶发酵L-精氨酸产量可提高36.0%。 (5)结合上述利于L-精氨酸合成的三种有效代谢改造方式——抗反馈抑制、加强目标代谢流和削弱竞争代谢途径,构建高产L-精氨酸重组钝齿棒杆菌SYPA 5-5△proB-9039SDB,在L-脯氨酸合成途径敲除的基础上引入抗反馈抑制精氨酸合成关键基因簇过量表达。对重组菌进行发酵产酸并对分析了其代谢分布优势,节点处的流量分配明显朝着有利于L-精氨酸合成的方向改变,使得重组菌L-精氨酸合成速率显著提高;5 L发酵罐产酸50.12 g/L,糖酸转化率为33.4%;且单位细胞的L-精氨酸得率明显优于出发菌株。本研究成功构建了高产精氨酸重组工程菌,显著提高了L-精氨酸的产量,同时为氨基酸代谢工程研究提供一定的理论和实践基础。