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美拉德肽的形成机理及功能特性研究

刘平  
【摘要】:美拉德反应不仅赋予食品特殊的香味、滋味和颜色,而且可产生具有较强抗氧化效果的活性物质,已广和发酵酱制品的呈味核心。但传统的美拉德肽制备方法是采用二次超滤技术,该工艺繁琐且成本较高,限制了其在食品工业中的广泛应用。因此,探索美拉德肽的形成机理,以寻找美拉德肽的合适泛应用于咸味香精和调味料基料的生产,其产物还作为抗氧化剂应用于肉类及焙烤类等多种食品的加工。美拉德肽是还原糖与肽的美拉德反应产物(MRPs),具有增强呈味食品的鲜味、醇厚味和持续感,是咸味调味料底物及高效转化方法,对风味增强肽呈味料的开发具有十分重要的理论意义。 本论文以大豆分离蛋白为原料,研究了美拉德反应风味料底物肽的酶解工艺、美拉德反应对美拉德肽形成的影响、美拉德肽的形成机理、大豆肽MRPs的挥发性风味物质、抗氧化活性及其在鸡汤中的应用效果,主要内容如下: 以水解度和肽氮率为指标,筛选出合适的内切蛋白酶,并结合大豆肽MRPs的感官评定确立了Alcalase酶与Flavourzyme酶双酶分步酶解的工艺条件:底物浓度为6%的大豆分离蛋白,经热处理后于60℃下加入2000 U/g底物Alcalase酶水解时间3 h,再于50℃下加入80 U/g底物Flavourzyme酶继续作用4 h。在此条件下所制得的大豆肽的美拉德反应产物具有较好的风味增强特性,此时水解度和肽氮率分别达12.43%和55.58%。 通过超滤技术制备五种不同分子量分布的大豆肽SP1、SP2、SP3、SP4和SP5,其相对分子质量1000-5000的肽段百分含量分别为2.75%、9.46%、19.57%、50.24%和74.51%。研究该五种大豆肽(SPs)与木糖(Xyl)在不同加热温度(100~140℃)和不同时间(0~180min)形成美拉德肽的规律。结果表明,随反应温度和时间的增加,各体系pH逐渐降低,褐变强度逐渐增强,其中SP1-Xyl体系中该两指标的变化最大,其次是SP2-Xyl体系,而SP5-Xyl体系变化最低。低温下,各体系中游离氨基酸含量随着温度的升高均降低,高温下,它在SP1/SP2/SP3-Xyl体系中的变化无规律,而在其它体系中持续增加。随着反应时间的延长,各体系中游离氨基酸含量先降低而后稳步增加。随着反应温度的升高,SP1-Xyl和SP2-Xyl体系中美拉德肽含量逐渐增加,相对分子质量小于1000的产物含量逐渐减少,大于5000的产物含量逐渐增加;SP3-Xyl体系中美拉德肽含量变化不显著;SP4-Xyl和SP5-Xyl体系中美拉德肽含量逐渐降低,相对分子质量大于5000的产物含量逐渐增加,小于1000的产物含量仅在后者体系中显著增加。反应时间对各产物中不同分子量段产物的影响趋势基本与温度的影响一致。结合感官评定结果,最终确定制备风味增强肽调味基料时反应温度和时间应控制在120~130℃和120~150min为宜。在整体接受性上,各体系在120℃下120min的产物在鲜味溶液中的呈味强弱依次是:SP5-XylSP4-XylSP3-XylSP2-XylSP1-Xy。尽管前两体系产物的风味增强效果最好,但SP2-Xyl和SP3-Xyl体系也表现了较好的风味增强效果,更适合于工业化生产。 采用二甘肽、谷胱甘肽(GSH)和六肽(cys-glu-lys-his-ile-met)与木糖模式体系分析较大分子糖肽交联物的形成途径,以此推测美拉德肽的形成机理。荧光分析显示,各肽与糖反应后有一新峰生成,且随反应时间的延长该峰在420~430nm处的最大荧光强度逐渐增强。经凝胶色谱检测,各体系较大分子量分布的肽产物的比例显著增加,尤其是六肽-木糖体系中美拉德肽含量可高达52.90%。通过葡聚糖凝胶G-10和二次HPLC色谱技术对二甘肽-木糖体系的MRPs进行分离,经LC-MS技术检测到分子离子峰中较大的m/z值是379,GSH-木糖体系MRPs中分子离子峰中较大的m/z值是616,该两分子离子峰的含量随反应时间的延长而显著增加。同时采用二甘肽/谷胱甘肽-[13C5]-木糖体系作对照,进一步确定了该两分子离子峰对应的碎片离子峰和源于母体糖的碳原子个数,以此推测所对应化合物可能的结构和形成途径。而六肽-木糖体系产物中检测到的分子离子峰的m/z值几乎都低于1000,并未检测到如凝胶色谱测出大分子产物的分子离子峰,同时发现该体系MRPs的分子离子峰在m/z 700~1100范围内有一段密集组分,且随着美拉德反应时间的延长,产物中该段密集组分随之增加。初步推测,各小肽与木糖形成的较大分子产物可能是由肽与木糖或其衍生物通过一系列反应交联形成。由此推测,美拉德肽可通过一定分子量分布的小肽与还原糖的交联反应制备。 各大豆肽的MRPs中共分离鉴定出131种挥发性化合物,其中吡嗪、呋喃、吡咯、醛、酮、醇、酸、酯和醚类化合物的含量较高。而来源于SP1的MRPs中挥发性化合物含量明显高于其它四种肽产物。抗氧化结果表明,美拉德反应可显著提高大豆肽的还原能力、DPPH自由基清除能力和螯合Fe2+的能力,但各体系间差异不显著。通过主成分分析(PCA)考察了五种MRPs的抗氧化和挥发性化合物间的相关性,发现大豆肽MRPs的还原能力和螯合Fe2+的能力与产物中挥发性杂环化合物呈明显的正相关。 在鸡汤中的应用结果表明,各大豆肽的MRPs显著增强了鸡汤的鲜味、醇厚味和持续感,但对香气没有明显的改善。五种MRPs在鸡汤中的应用效果与鲜味溶液类似,结果进一步表明,SP4和SP5的MRPs适用于高品质风味料或其基料的制备,SP2和SP3体系产物适用于大规模开发成本低廉且具有良好风味增强效果的风味料。


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