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刚性陶瓷/琼脂糖复合蛋白质层析介质的制备及应用研究

金雄华  
【摘要】:液相层析技术是生物分离过程中的一个重要单元,具有分辨率高、操作设备简单和有利于保持生物大分子的活性等优点,是一种最有效、最普遍采用的生物分离方式之一。而层析技术的关键就是层析介质,随着科技的进步和对生物产品需求的不断增长,层析介质的性能也得到了不断的提高。本文以刚性陶瓷/琼脂糖复合层析介质的制备、功能化及应用为目标,以复合介质的制备为中心,希望开发一种具有新型结构的层析介质,主要开展了以下几方面的工作: (1)制备多孔氧化硅陶瓷微球。以纳米氧化硅粉体为骨架材料,PEG10000为致孔剂,海藻酸钠溶液为胶黏剂,采用反相悬浮法制备陶瓷微球生胚,再通过高温烧结得到一种孔隙率高、机械强度大、球形度好的多孔陶瓷微球。经氮气吸附实验测定,其比表面积达28.75 m2/g,BJH平均孔径为33.3 nm,BJH孔容为0.246 m3/g;并且其流通性能良好,在764 cm/h的高操作流速下柱背压只有0.18 MPa。 (2)制备了刚性陶瓷/琼脂糖复合层析介质。采用热渗透法将琼脂糖凝胶填充到多孔陶瓷微球中,再通过研磨、筛选和流化床淘洗的方式去除微球表面的琼脂糖凝胶,得到一种复合介质。其湿真密度为1.70 g/mL,平均粒径为65.3μm,经性能评估可知复合介质在耐受柱压、柱效、装柱速度等方面均优于传统琼脂糖基填料6FF,较适宜用于制备型蛋白质层析。 (3)将复合介质功能化为阳离子交换剂并考察其蛋白质吸附性能。首先,采用二次交联法对复合介质进行化学修饰并偶联氯乙酸,制备得到CM-复合介质,其离子交换容量为72.4μmol/mL。然后,以溶菌酶为模型蛋白考察了其等温吸附曲线、吸附动力学曲线和不同流速下的穿透曲线。结果表明其静态饱和吸附容量为55.9 mg/mL,符合二级吸附动力学模型;在高操作流速时依然可对蛋白质进行有效吸附。 (4)将复合介质功能化为具有谷胱甘肽功能基团的亲和层析介质,并实现了对谷胱甘肽转移酶融合蛋白的纯化。经优化,复合介质的环氧基团活化密度为13.1μmol/mL,GSH配基密度为10.2μmol/mL,偶联效率达77.8 %;之后考察了洗脱方式、上样量和操作流速对介质吸附性能的影响。结果表明,谷胱甘肽亲和作用具有专一性好的特点,目标蛋白可被完全吸附;线性洗脱或梯度洗脱都能达到目标纯度;并且复合介质具备较高的吸附容量,可在较高操作速度下应用,较适合融合蛋白的纯化。


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