转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌发酵产精氨酸中的作用研究

【摘要】：L-精氨酸是一种重要的氨基酸,具有多种独特的生理和药理作用,在医药、食品等领域有着广泛的应用。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是本实验室多级诱变筛选获得的一株高产L-精氨酸生产用菌株。 增加合成途径中酶的表达量是提高L-精氨酸合成途径的代谢通量最终提高其产量最重要的策略之一,但研究发现,微生物细胞内氨基酸合成的通量增加会导致胞内积累量远高于原始菌株,表明改造后的菌株氨基酸转运能力很局限。L-精氨酸从胞内分泌到胞外依靠的是转运蛋白。本论文以Corynebacterium crenatum SYPA5-5菌株为研究对象,通过基因敲除的方法对L-精氨酸转运蛋白LysE在其发酵生产L-精氨酸中的作用作了初步研究,从氨基酸分泌的角度来考虑解除L-精氨酸反馈抑制,并通过加强L-精氨酸转运蛋白的表达,最终使得L-精氨酸发酵产量有所提高。 来自钝齿棒杆菌的L-精氨酸转运蛋白LysE和来自大肠杆菌的L-精氨酸转运蛋白ArgO均为跨膜蛋白,在大肠杆菌中研究两者的克隆表达情况,结果表明自钝齿棒杆菌的lysE基因与谷氨酸棒杆菌ATCC13032 lysE基因的核苷酸序列同源性为99.7%。融合表达载体pGEX-6P-1能在大肠杆菌中增强这两种蛋白的表达量,实现融合表达,并通过Western Blot鉴定了GST融合蛋白。 本文构建了一种基于一株大肠杆菌L-精氨酸缺陷菌株的平板显色法用以初步定性检测L-精氨酸分泌,对其进行可行性实验分析,结果表明该方法用于定性检测精氨酸分泌情况有效可行。 利用自杀载体pK18mobsacB成功敲除了C.crenatumSYPA5-5的lysE基因,获得lysE基因缺失菌△lysE/C.crenatum,分别在该缺失菌和原始菌中增强LysE的表达获得pJC-tac-lysE/(△lysE/C.crenatum)和pJC-tac-lysE/C.crenatum。对缺失菌、缺失加强菌、原始菌及原始加强菌进行平板显色定性检测并进行基本培养基培养实验考查L-精氨酸转运情况,初步验证了L-精氨酸转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌中的功能,LysE的缺失会导致细胞内L-精氨酸高于正常水平,增强LysE的表达能够一定程度上减弱LysE的缺失带来的胞内L-精氨酸的积累,当钝齿棒杆菌细胞内L-精氨酸的量超过一定水平时LysE能将细胞内L-精氨酸运输到细胞外。 基于以上研究,对lysE基因缺菌、缺失加强表达菌、原始菌以及原始加强菌进行250 mL摇瓶发酵实验,进一步验证了LysE在钝齿棒杆菌发酵产L-精氨酸中的作用。且在L-精氨酸产量方面,与原始菌株相比,原始加强菌胞外产量提高了约12%,且发酵周期有所缩短,表明在钝齿棒杆菌增强转运蛋白LysE的表达对提高L-精氨酸产量有一定意义。