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耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶的构建及其酶学性质研究

孙军涛  
【摘要】:β-1,3-1,4-葡聚糖酶(β-1,3-1,4-glucanase, E.C.3.2.1.73,简称β-葡聚糖酶)属于糖基水解酶类,降解β-葡聚糖中与β-1,3糖苷键相邻的β-1,4糖苷键。β-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶,广泛应用于啤酒和饲料工业中。在啤酒生产过程中,大麦中的β-葡聚糖会降低麦芽汁和啤酒过滤速度,在啤酒贮存过程中容易引起沉淀等问题;在畜禽饲料中如含有较多的β-葡聚糖会增加食糜粘度,影响动物内源性消化酶与营养物质的接触,降低饲料的消化率。β-葡聚糖酶可有效避免β-葡聚糖在酿造和饲料工业中的上述不良影响,提高啤酒的质量和饲料的消化率。 热稳定性差和催化活性低是当前β-葡聚糖酶在工业应用中普遍存在的问题。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)β-葡聚糖酶在酸性条件具有较高的酶活性,但其热稳定性较差;热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)是一种嗜热的厌氧菌,其所产生的β-葡聚糖酶的热稳定性高于芽孢杆菌所产生的β-葡聚糖酶,但酶活力较低。本研究以热纤梭菌β-葡聚糖酶和解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因为研究材料,采用基因重叠延伸技术(SOE),将二者β-葡聚糖酶基因进行杂合和融合,构建耐热、高活性的β-葡聚糖酶。研究的主要结果如下: 1.构建了解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶。经摇瓶发酵培养,该酶的酶活性为80U mL~(-1),纯化后酶的比活力为1106U mg~(-1),最适反应温度和pH分别为50℃和6.0,在pH5.0-7.0范围内,具有较高的酶活性;以大麦葡聚糖为底物时,该酶的米氏常数(K_m)和催化效率常数(K_(cat)/K_m)分别为1.5mg mL~(-1)和369mL mg~(-1)s~(-1);在80℃温度下处理30min,解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶仅有16%的残余酶活,具有较低的耐热性。 2.构建了热纤梭菌缺失锚定结构域β-葡聚糖酶。经摇瓶发酵培养,该酶的酶活性为7.8U mL~(-1),纯化后的比活力为275U mg~(-1),最适反应温度和pH分别为70℃和8.0,在pH7.0-9.0范围内,具有较高的酶活性;该酶的K_m和K_(cat)/K_m分别为2.7mg mL~(-1)和51mL mg~(-1)s~(-1),在80℃温度下处理30min,有60%的残余酶活;与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶相比,热纤梭菌缺失锚定结构域β-葡聚糖酶的催化活性较低,但具有较高的热稳定性。 3.融合β-葡聚糖酶的构建。将热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13个和27个氨基酸残基分别与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶N端融合,构建融合β-葡聚糖酶,分别命名为R13和R27。纯化后R13和R27的比活力分别为1074U mg~(-1)和1013U mg~(-1),它们的最适反应温度和pH分别为60℃和6.0;在80℃温度下处理30min,R13和R27分别保留34%和52%的残余酶活,分别高出解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶残余酶活的18%和36%,但它们的耐热性均低于热纤梭菌β-葡聚糖酶。表明融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13个和27个氨基酸残基,能够提高解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的耐热性。酶催化动力学研究表明,R13的K_m和K_(cat)/K_m分别为1.7mg mL~(-1)和324mL mg~(-1)s~(-1),R27的K_m和K_(cat)/K_m分别为1.9mg mL~(-1)和288mL mg~(-1)s~(-1)。与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的催化活性相比较,R13和R27均有不同程度的降低,说明解淀粉芽孢杆菌N-端融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13或27个氨基酸残基后,降低了解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶与底物的亲和力,进而影响了酶的催化活性,其中融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端27个氨基酸残基对解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶催化活性的抑制作用大于融合13个氨基酸残基的抑制作用。 4.双催化结构域β-葡聚糖酶的构建。将解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的催化结构域和热纤梭菌β-葡聚糖酶的催化结构域连接,构建双催化结构域β-葡聚糖酶。构建的双催化结构域β-葡聚糖酶命名为RQ,纯化后RQ的比活力为2434U mg~(-1),RQ的最适反应温度和pH分别为70℃和6.0;耐热性研究表明,在80℃温度下处理30min,RQ有67%的残余酶活,分别高出R13和R27残余酶活的33%和15%,RQ的耐热性与热纤梭菌β-葡聚糖的耐热性相接近;RQ的K_m和K_(cat)/K_m分别为1.2mg mL~(-1)和1014mL mg~(-1)s~(-1),其催化效率分别是R13和R27催化效率的3.13倍和3.52倍,也是解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶催化效率之和的2.41倍。以上结果表明:RQ的酶学性质并不是简单的解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶的酶学性质的叠加,而是赋予了新的酶学特性的β-葡聚糖酶,它除具有热纤梭菌β-葡聚糖酶的热稳定性外,其催化效率也高于解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶的催化效率之和。热纤梭菌β-葡聚糖酶的连接子可有效改善双催化结构域β-葡聚糖酶的耐热性和催化活性。 5.双催化结构域β-葡聚糖酶的耐热机理初步研究。将RQ中热纤梭菌β-葡聚糖酶的两个催化活性位点的谷氨酸(E134和E138)定点突变为丙氨酸(E134A和E138A),构建含点突变的双催化结构域β-葡聚糖酶,并命名为RQM。耐热性研究表明,在80℃温度下处理30min,RQM有57%的残余酶活,分别比解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶、R13和R27的耐热性提高了41%、23%和5%;与热纤梭菌β-葡聚糖酶和RQ的耐热性相比,RQM的耐热性分别降低了3%和10%。说明热纤梭菌β-葡聚糖酶不仅其N-端对RQ的耐热性有影响,而且其催化结构域的整个结构在稳定酶分子中发挥作用,包括其催化活性位点,热纤梭菌β-葡聚糖酶催化结构域和解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶催化结构域之间相互影响,产生协同效应,形成一种特性优良的、新的β-葡聚糖酶。 6.双催化结构域β-葡聚糖酶发酵培养基和培养条件如下:大麦粉43.48g L~(-1)、豆粉34.40g L~(-1)、NaCl2.40g L~(-1)、KH_2PO_42.40g L~(-1)和K_2HPO_412.50g L~(-1);接种量1%(V/V)、装样量45mL/250mL、发酵培养基初始pH6.0-7.0、最佳诱导时期为在200rpm转速下培养3h后诱导。优化后的发酵培养基产β-葡聚糖酶的量为110U mL~(-1),比初始发酵培养基提高了11%。虽然发酵产β-葡聚糖酶的量没有得到大幅度提高,但是优化后的发酵培养基中的碳源和氮源是廉价的大麦粉和豆粉,大大降低了β-葡聚糖酶的生产成本,具有很好的实际应用价值。


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