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L-谷氨酸氧化酶菌株的选育及基因的克隆与表达研究

卢婵  
【摘要】:L-谷氨酸氧化酶(EC1.4.3.11,LGOX)是以FAD为辅酶的一种L-氨基酸氧化酶,广泛应用于测定食品、发酵和医药行业L-谷氨酸的含量及其有关的偶联反应。从二十世纪八十年代开展对L-谷氨酸氧化酶的研究至今,国内外所报道的生产L-谷氨酸氧化酶的菌株不多,其产酶能力普遍较低。为获得优良产L-谷氨酸氧化酶的菌株,本论文主要进行了以下研究: 产酶菌株的筛选与鉴定:对土壤进行富集处理,采用4-氨基安替吡啉/苯酚显色反应的方法,筛选出一株产L-谷氨酸氧化酶的菌株Str-6。从形态、培养特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,将该菌株Str-6鉴定为山丘链霉菌。其16S rDNA序列在Genbank的登记号为JX050226。其发酵产L-谷氨酸氧化酶酶活为1.62×10~(-3)U/mL。 产酶菌株的诱变与产酶培养基的优化:采用硫酸二乙酯和紫外对菌株进行诱变,从突变株中选育出了一株产酶性能较稳定的菌株Str-U8,其L-谷氨酸氧化酶酶活为1.98×10~(-3)U/mL,为出发菌株的1.2倍。对产酶培养基碳氮源、诱导剂和初始pH进行了优化,得出最佳的产酶培养基为:葡萄糖2.5%、玉米浆0.8%、(NH_4)_2SO_40.6%、CaCO_33%、CaCl_20.3%、MgCl_2·6H_2O0.1%、KCl0.1%和L-谷氨酸0.9%,pH6.5。在该条件下,菌株Str-U8的L-谷氨酸氧化酶酶活提升至3.40×10~(-3)U/mL,为出发菌株的2.1倍。该菌L-谷氨酸氧化酶为胞外酶,属于生长同步型。粗酶的最适反应温度为35℃、最适反应pH为6.0,除作用于L-谷氨酸外,对天门冬酰胺和谷氨酰胺有微弱反应。 L-谷氨酸氧化酶基因的克隆、表达:将来自Streptomyces sp. X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因与表达载体pET28a连接,导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。在IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导时间为6h、诱导温度为30℃的条件下,L-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.1U/mg。在3L发酵罐上,重组菌BL21(DE3)/pET28a-LGOX产L-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.61U/mg。 重组L-谷氨酸氧化酶的酶学性质:采用HisTrap~(TM)FF亲和层析的方法,获得单一的L-谷氨酸氧化酶蛋白条带,纯化后L-谷氨酸氧化酶比酶活为2.1U/mg,蛋白纯化倍数为1.9倍。该酶的最适反应温度为37℃、最适反应pH为5.0,除作用于L-谷氨酸外,只对谷氨酰胺有微弱酶活。在最适反应条件下,对L-谷氨酸的K_m值为2.12mmol/L,V_(max)为1.0645μmol/min·mg。


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