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基于2-DE技术筛选钝齿棒杆菌SYPA5-5启动子及其功能研究

张博慧  
【摘要】:钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5是本课题组从土壤中筛选获得的一株高产L-精氨酸的突变株。应用于钝齿棒杆菌SYPA5-5遗传表达体系的启动子效率不够高。因此筛选钝齿棒杆菌内源高活性启动子是提高其遗传表达体系效率的重要手段。本研究基于2-DE技术对钝齿棒杆菌内源高效启动子进行了筛选,主要研究研究结果如下: (1)分别在常规条件(搅拌转速400r/min,通气量3L/min)和高低溶氧条件(搅拌转速600r/min,通气量4L/min;搅拌转速300r/min,通气量2L/min)下发酵钝齿棒杆菌SYPA5-5,利用双向电泳获得了5个组成型高表达蛋白分别为N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶、精氨酸琥珀酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、乙酮醇酸还原异构酶和磷酸甘油酸脱氢酶,和3个受溶氧影响显著的蛋白分别为高溶氧上调蛋白转酮醇酶和延胡索酸水化酶,低溶氧上调蛋白L-2,3-丁二醇脱氢酶。 (2)克隆了目的蛋白编码基因的上游启动子,获得了组成型启动子P-argC、P-argG、P-argF、P-ilvC、P-serA和溶氧诱导型启动子P-tkt、P-fum、P-bdh,分别将其替换构建的棒杆菌-大肠杆菌无启动子的穿梭探针载体pDXW-P-gfp/cat的tac启动子,通过检测报告基因gfp和cat的表达情况验证启动子的功能。 (3)将携带组成型启动子的重组菌在常规条件下发酵,结果表明组成型启动子的活性大小为:P-argG P-argF P-ilvC tac P-argC P-serA。其中携带P-argG、P-argF、P-ilvC的重组菌绿色荧光蛋白GFP荧光亮度和氯霉素乙酰转移酶CAT酶活力均较高。重组钝齿棒杆菌中CAT酶活力在摇瓶水平上分别达到了4.84U/mg、4.43U/mg和2.91U/mg,均超过了tac启动子的2.22U/mg,并在5L发酵罐中验证了P-argG和P-argF的功能。 (4)将携带溶氧诱导型启动子P-tkt、P-fum和P-bdh的重组菌在高低不同溶氧条件下发酵,结果显示在重组大肠杆菌和重组钝齿棒杆菌中,P-tkt在高溶氧条件下CAT活性是低溶氧条件下CAT活性的1.80和1.74倍;P-bdh在低溶氧条件下CAT活性是高溶氧条件的2.0和1.99倍,该结果在5L发酵罐中得到验证。


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