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豌豆分离蛋白酶解产生物活性肽的研究

张秋萍  
【摘要】:生物活性肽具有特殊的生理功能,利用酶解技术加工植物蛋白制备的生物活性肽,可应用于食品、医药、化妆品等领域中。 本文以豌豆分离蛋白为原料,通过酶解技术分别制备抗菌和抗氧化活性肽,并对活性组分进行分离纯化、基本特性研究和应用潜力初探。 以水解度为指标,单因素实验确定单一几种蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)对豌豆蛋白的较适水解条件,4种蛋白酶在较适条件下对豌豆分离蛋白产生的水解度由大到小依次为:胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。采用凝胶层析分析获得的各种单一酶解产物的分子量分布特点。 对不同酶解产物进行抗菌能力测定,以金黄色葡萄球菌为指示菌,筛选出木瓜蛋白酶,明确其单一酶产抗菌肽的较优水解条件为:酶底比(w/w)2.5%、温度65℃、pH6.5、底物浓度(w/v)5%、水解时间2h,此条件下的水解产物的抗菌作用表现出相对广谱性。使用乙醇分级沉淀、DEAE-52Cellulose离子交换层析、SuperdexTMpeptide10/300GL凝胶层析、Resource Q离子交换层析得到纯化的豌豆抗菌肽组分。抗菌肽组分相对分子量范围为1.9~3.7kDa;对金黄色葡萄球菌最小抑制浓度为0.25mg/mL;含有9种氨基酸,其中谷氨酸含量高达35.46%;酸性条件下抗菌能力较明显,pH为6.0时抗菌效果最好;具有热稳定性和耐热性;豌豆抗菌肽(10mg/mL)对金黄色葡萄球菌的抗菌效力与10.72U/mL的硫酸卡那霉素和2.08U/mL的庆大霉素的抗菌效果相当。 对不同酶解产物进行抗氧化活性测定,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为指标,优选出在各自较适水解条件下,中性蛋白酶和胰蛋白酶组合分步酶解方案,所得豌豆蛋白水解产物(pea protein hydrolysate,PPH)对DPPH的半清除浓度(IC50)为3.01mg/mL。PPH经Sephadex G-25凝胶层析和两次RESOURCETM3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽,浓度在0.2mg/mL时对DPPH的清除率达到62.03%,与同浓度下的谷胱甘肽对DPPH的清除率相近(66.82%)。经液质联用分析推测出纯化所得的抗氧化肽相对分子量为956.5Da,氨基酸序列为Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu。 选用纳滤膜对PPH进行脱盐浓缩处理,脱盐率达到79.87%,PPH浓缩2.86倍,随后以不同添加量加到润肤霜中,经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力,初步探明该豌豆抗氧化肽在功能型化妆品中的应用潜力。


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