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克雷伯氏菌强化表达dhaT基因对1,3-丙二醇合成影响的研究

苏江伟  
【摘要】:1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一种重要的三碳化合物,是纺织、医药和化妆品等行业的重要化工原料,特别是新型聚酯类纤维聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的商业化以来,因其巨大的商业价值越来越受关注。克雷伯氏菌(Klebsiella)以甘油为底物生产1,3-PDO的代谢过程中,dha T基因编码合成的1,3-丙二醇氧化还原酶是甘油转化为1,3-PDO的关键酶。本研究通过在Klebsiella中强化表达dha T基因及强化NADH的再生,旨在增强甘油到1,3-PDO的转化,探究其对Klebsiella产1,3-PDO的影响和代谢流的变化。本研究利用基因分子改造技术,构建过表达dha T基因的克雷伯氏重组菌K.pneumoniae(p Etac-dha T);酶活测定显示1,3-丙二醇氧化还原酶与对照菌株K.pneumoniae(p Etac)相比提高了94.3%;摇瓶发酵结果显示,重组K.pneumoniae(p Etac-dha T)的1,3-PDO的产量达到了19.5 g·L-1,相较于对照菌株有少量提高,同样甘油摩尔转化率稍有提高,达到了0.618。研究结果表明单纯过表达dha T基因不能明显增强3-羟基丙醛到1,3-PDO的转化,推测其原因可能是辅酶NADH的不足限制了1,3-丙二醇氧化还原酶催化合成1,3-PDO的反应。为了提高NADH再生速率,过表达Saccharomyces cerevisiae中的编码甲酸脱氢酶的基因fdh1和丙酮酸甲酸脱氢酶基因pfl B,强化丙酮酸-CO2途径。为此采用分子生物学手段构建了重组菌K.pneumoniae(p Etac-pfl B)、K.pneumoniae(p Etac-fdh1)、K.pneumoniae(p Etac-pfl B-tac-fdh1)。发酵结果显示,与对照菌株K.pneumoniae(p Etac)相比,三株重组菌的1,3-PDO产量与对照菌株相比分别提高了8%、12%、18%,摩尔转化率分别提高了7.3%、13.2%、19.5%,并且三株重组菌的胞内的NADH和NAD+均显著高于出发菌株。此外,除乙酸外其他副产物都有不同程度的降低。为进一步利用再生的辅酶NADH,提高1,3-PDO转化率,构建同时强化dha T基因和丙酮酸-CO2途径的Klebsiella,得到K.pneumoniae(p Etac-pfl B/p RSF19-tac-dha T-tet)、K.pneumoniae(p Etac-fdh1/p RSF19-tac-dha T-tet),K.pneumoniae(p Etac-pfl B-tac-fdh1/p RSF19-tac-dha T-tet)。摇瓶发酵显示,三株重组菌1,3-PDO产量与对照菌株K.pneumoniae(p Etac/p RSF19-tac-dha T-tet)相比分别提高了5.9%、9.8%、20.2%,分别达到了20.69 g·L-1、21.45 g·L-1、23.46 g·L-1,1,3-PDO的转化率分别提高了7.5%、9.8%、20.1%。研究结果表明在Klebsiella中,胞内NADH含量对1,3-丙二醇氧化还原酶催化生成1,3-PDO的限制作用大于1,3-丙二醇氧化还原酶本身对合成1,3-PDO的限制,这为进一步研究利用克雷伯氏菌生物合成1,3-PDO提供了有利的参考。


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