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镰刀菌毒素核酸适配体的筛选及分析应用研究

陈秀娟  
【摘要】:核酸适配体(aptamer)是经SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment,指数富集的配体系统进化)技术体外筛选获得的一段具有特定复杂三维构象、可与靶标特异性结合的寡核苷酸片段。核酸适配体具有特异性强、亲和力高、低成本快速复制、易于化学修饰等优点,经过二十多年的发展,已成为一种新型识别元件在医疗诊断与临床治疗、分析检测和分离纯化等领域发挥广泛作用。但真菌毒素相应核酸适配体的缺乏,严重限制了该类高效能识别元件在真菌毒素分析检测研究中的应用。本研究以几种最重要的镰刀菌毒素(玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、T-2毒素)为研究对象,运用改进的SELEX方法筛选得到镰刀菌毒素特异性结合DNA适配体,结合磁分离富集技术、电化学阻抗谱技术、纳米金比色分析技术,构建了一系列新颖、灵敏、便捷的真菌毒素检测新方法。相关研究成果,对于丰富SELEX筛选方法、拓展核酸适配体的应用范围,为后续镰刀菌毒素有效检测方法的构建奠定了基础。首先,利用靶标固定化的磁珠-SELEX法筛选玉米赤霉烯酮的特异性结合适配体,并研究将其作为识别元件在玉米赤霉烯酮检测中的应用。将玉米赤霉烯酮共价偶联在氨基化磁珠表面,通过14轮的严格筛选得到适配体富集库,经克隆测序后对得到的候选适配体进行亲和力与特异性鉴定,获得了一条特异识别玉米赤霉烯酮的最佳适配体Z8。进一步通过二级结构模型预测和圆二色谱分析,研究适配体Z8与游离靶标玉米赤霉烯酮之间的结合机理。随后,将适配体Z8修饰在磁性纳米颗粒上制成捕获探针,构建了一种基于适配体特异捕获-荧光分析法检测玉米赤霉烯酮的新方法,在实验优化条件下,玉米赤霉烯酮荧光强度值与其浓度对数值在3.14 nmol~31.4μmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为785 pmol/L,所建方法被成功应用于啤酒样品中玉米赤霉烯酮的加标检测。其次,利用靶标固定化的磁珠-SELEX法筛选伏马菌素B1特异性结合适配体。将伏马菌素B1固定在氨基化磁珠表面,通过13轮的严格筛选得到适配体富集库,经克隆测序得到适配体候选序列,通过结合解离实验、竞争解离实验、圆二色谱分析对适配体候选序列的亲和力、特异性、结合机制进行评价对比,鉴定得到了一条特异识别伏马菌素B1的最佳适配体F10,为后续检测方法的建立奠定了良好基础。第三,研究基于适配体识别的电化学阻抗传感器在伏马菌素B1检测中的应用。以特异识别伏马菌素B1的适配体为识别元件,利用金-硫键作用将巯基化适配体ap F10锚定在电极表面修饰的纳米金上,以[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原反应对,监测伏马菌素B1与适配体相互作用界面的电荷传递电阻变化(Ret)。在实验优化条件下,电化学阻抗变化(Ret)与伏马菌素B1浓度对数值在0.1 nmol/L~100μmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为2 pmol/L,所建方法被成功应用于玉米样品中伏马菌素B1的加标检测。第四,利用靶标非固定化的氧化石墨烯(GO)-SELEX改进方法筛选T-2毒素特异性结合适配体。基于GO能够吸附非特异单链DNA但不吸附与靶标结合DNA的原理,根据T-2毒素特性定制GO-SELEX筛选方案,经过10轮的严格筛选获得了适配体富集库,经克隆测序得到适配体候选序列,分析比对适配体全长序列及截短序列的亲和力与特异性,鉴定得到一条特异识别T-2毒素的最佳适配体Seq.16,为T-2毒素新型检测方法的建立奠定了基础。第五,建立了基于适配体分离-乙酰胆碱酯酶抑制的T-2毒素可视化检测新方法。以T-2毒素适配体Seq.16功能化磁性纳米颗粒为捕获探针,利用高效的磁分离富集技术从待测样品体系中分离纯化目标物T-2毒素;利用T-2毒素抑制乙酰胆碱酯酶活性阻碍硫代胆碱生成从而防止纳米金聚集变色的原理,建立了一种基于乙酰胆碱酯酶抑制的纳米金比色检测T-2毒素的新方法。在实验优化条件下,纳米金溶液吸光度值A520 nm与T-2毒素浓度对数值在107 pmol/L~2145 pmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为107pmol/L,所建方法被成功应用于啤酒样品中T-2毒素的加标检测。总之,本论文构建了适用于真菌毒素适配体筛选的靶标固定化与非固定化SELEX方法,获得了玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、T-2毒素等重要镰刀菌毒素的特异识别核酸适配体,利用该新型识别元件的高亲和力、高特异性、稳定性及易于化学修饰等优势,结合高效便捷的磁分离技术以及高灵敏的荧光分析技术、电化学阻抗谱技术、纳米金比色技术,将适配体成功应用于食品基质中的目标镰刀菌毒素检测,拓展了核酸适配体在真菌毒素检测领域的应用范围。


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