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油茶籽糖蛋白的分离纯化及其功能活性研究

李婷婷  
【摘要】:油茶是我国特有的优良木本油料植物,以产出油茶籽油而著称,同时它也是一种集油料、医药、化工、饲用、观赏为一体的多用途植物。目前在我国,油茶的主要用途是作为油料作物提取食用油,而传统医学所记载的油茶的药用价值未被重视,这种优质资源的利用途径尚显单一。随着油茶产业的发展,油茶及其副产物资源的精深加工和综合开发利用程度低等问题,成为制约油茶产业发展的瓶颈。本文从提升油茶副产物综合利用度、拓展油茶利用途径角度着手,以油茶籽粕为原料,从中提取油茶籽糖蛋白,并对其进行分离纯化,研究其性质结构以及抗氧化、抗肿瘤活性,探讨其抗氧化、抗肿瘤的机理,这将为提升油茶资源的利用价值,增强油茶的高附加值综合开发利用途径,丰富活性糖蛋白的种类和功能,具有重要的理论和现实意义。 利用响应面法对缓冲溶液法和水提法两种方法提取油茶籽糖蛋白的关键影响因子进行了优化,并建立了回归模型,所得方程拟合性好。其中缓冲溶液法在最优条件下的蛋白得率为8.76%,糖得率为10.14%,水提法最优条件下蛋白得率为8.96%,糖得率为17.05%。采用MTT试验法考察缓冲溶液法和水提醇沉法所得的油茶粗糖蛋白的体外抗肿瘤活性,结果表明油茶粗糖蛋白对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803、人乳腺癌细胞MCF-7均有一定的抑制作用,其中对HepG2癌细胞的抑制率最高。两种方法提取的油茶粗糖蛋白对肝癌HepG2细胞的半抑制浓度IC50值分别为36.794和15.164μg/mL,其中水提醇沉法所得的油茶粗糖蛋白抗肿瘤效果较强。两种提取方法所得油茶粗糖蛋白对DPPH、·OH、O2·-自由基具有一定的清除能力以及呈现良好的还原力,其中水提醇沉法所得的油茶粗糖蛋白对清除DPPH、·OH、O2·-自由基的EC50值分别为2.771、2.051、7.282mg/mL。 以体外抗肿瘤和抗氧化活性为筛选导向,首先采用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱层析分离纯化油茶粕粗糖蛋白,得到COGY1、COGY2、COGY3三个组分,筛选出活性较强的组分COGY2。再以Sephadex G-100凝胶柱柱层析对COGY2继续进行分离纯化,得到COGY2a和COGY2b两个组分,对体外抗肿瘤和抗氧化活性较强的组分COGY2a再经AKTA蛋白质分离纯化仪的SuperdexTMG-75凝胶柱纯化除杂,即得到高纯度的油茶籽糖蛋白COGP2a。SDS-PAGE电泳和HPGPC检测均表明COGP2a为单一条带和单一峰,其重均分子量为25956Da,并对油茶籽糖蛋白COGP2a进行了系列定性检测。DSC测定结果表明COGP2a的热变性温度为64.7℃,变性热焓值为120.6J/g,COGP2a的比旋光度为-32.5。 通过氨基酸组成分析、单糖组成分析、糖肽键特征分析、刚果红实验、红外色谱、圆二色谱、LC-Q-TOF-MS-MS对油茶籽糖蛋白COGP2a的结构信息进行了探讨。结果表明COGP2a中蛋白含量为54.28%,其氨基酸组成中含量最高的三种氨基酸依次为谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸。COGP2a中糖含量为45.29%,主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,其摩尔比为1.29﹕1.65﹕5.81﹕1﹕16.15﹕14.47,油茶籽糖蛋白COGP2a糖肽键型为O-糖肽键,其糖链是吡喃糖的-型糖苷键结构。其肽链部分经LC-Q-TOF-MS-MS分析测序得到3个匹配肽段序列,其m/z分别是1852.86、1304.63和1574.67。圆二色谱分析其二级结构表明-螺旋占80.3%,β-折叠占1%,β-转角占6.4%,无规则卷曲占15.8%。 以HepG2肿瘤细胞作为受试细胞,研究COGP2a对肿瘤细胞的凋亡作用。COGP2a作用后细胞的形态呈现典型凋亡状态。在荧光显微镜下,Hoechst33258进入COGP2a处理组的凋亡细胞,明显可见核染色体凝聚、边集浓染,呈现出亮蓝色强荧光。扫描电镜和透射电镜观测空白对照组和COGP2a处理组HepG2肿瘤细胞形态,发现经COGP2a处理后的HepG2细胞出现明显的核固缩、核裂解、细胞器异常现象,细胞膜微绒毛及表面褶皱消失,有大量的凋亡小体存在。PI和Annexin V-FITC双染后流式细胞仪检测了COGP2a处理HepG2细胞后的不同细胞阶段存在状态。JC-1染色流式细胞仪检测了COGP2a对HepG2细胞的线粒体膜电位影响,表明COGP2a可以促使HepG2肿瘤细胞的线粒体外膜的通道开放,导致线粒体跨膜电位改变,使ΔΨm下降。PI单染法检测COGP2a对HepG2细胞周期的影响,结果发现G0/G1期细胞比例下降,G2/M期细胞比率升高,COGP2a可使HepG2细胞由合成后期进入有丝分裂期时受阻而发生积累,从而阻滞了细胞进入下一个正常细胞增殖周期,导致处于G0/G1期的细胞减少,从而诱导细胞凋亡。Western blotting检测COGP2a对HepG2细胞中Caspase-3表达的影响表明,COGP2a可以明显促进Caspase-3表达水平的增高,激活死亡受体途径,从而诱导细胞凋亡。 通过建立H22肝癌ICR小鼠动物移植肿瘤模型评价COGP2a的体内抗肿瘤作用。在COGP2a高剂量组(200mg/kg/d)作用下对小鼠的肿瘤抑制率为72.77%,表明COGP2a在荷瘤小鼠动物体内具有较强的抗肿瘤作用。蛋白质印迹检测COGP2a对肿瘤组织的凋亡作用表明,COGP2a具有促进促凋亡蛋白Bax表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达作用。小鼠肿瘤组织病理学观察表明COGP2a作用后,呈现出肿瘤细胞体积缩小、细胞核固缩的凋亡坏死。此外,通过测定受试小鼠免疫器官指数、白细胞数和淋巴细胞数、T淋巴细胞细胞亚群、干扰素-γ等指标,结果发现COGP2a样品组可使小鼠的胸腺和胰脏指数、白细胞数和淋巴细胞数、CD4/CD8的比值、干扰素-γ指标不同程度的升高,表明COGP2a对受试小鼠的免疫系统无破坏作用,并且在一定程度上可以增强受试小鼠的免疫功能,COGP2a的抗肿瘤作用与其能够提高机体免疫力有关。 采用D-半乳糖氧化损伤动物模型,考察油茶籽糖蛋白COGP2a的体内抗氧化活性。结果表明,与模型组相比,COGP2a作用后小鼠的胸腺指数和脾脏指数有所升高(P0.05)。同时COGP2a还能极显著的增强小鼠血液和肝脏组织的SOD和GSH-PX活性,降低MDA和总羰基含量(P0.01)。这表明COGP2a对外源性氧化损伤动物模型具有较好的抗氧化作用。经统计学分析其体内抗肿瘤和抗氧化活性呈现显著正相关,这表明COGP2a的抗肿瘤作用与其清除自由基的抗氧化作用有相关性。


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