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类胡萝卜素脂质体的研究

谭晨  
【摘要】:类胡萝卜素作为重要的天然色素应用于食品、药物和化妆品之中。它是人体获得必需的维生素A的重要来源,并在机体内发挥着抗氧化、清除自由基及调节免疫等生理功能。但类胡萝卜素为脂溶性物质,在水中溶解性较差,口服利用度低。其分子结构中的不饱和双键对光、氧和热都不稳定,这使得它们在加工及应用中也存在很大的局限性。本课题以复合脂质(天然磷脂蛋黄卵磷脂和非离子型乳化剂吐温80)作为壁材,针对四种典型类胡萝卜素(番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素和斑蝥黄素)构建稳定、高效、生物可给率高的类胡萝卜素脂质体。对体系的物理化学特性、抗氧化活性和生物学效应等重要应用品质进行检测,确立影响类胡萝卜素脂质体稳定性和生理功能的关键影响因素。在此基础上,进一步研究天然生物大分子壳聚糖包覆对脂质体稳定性的“双重效应”,从分子水平探索核-壳结构纳米复合物形成和稳定的调控机制,实现对类胡萝卜素的稳定化和可控运载。 首先,通过动态光散射和原子力显微镜图像分析类胡萝卜素载入对脂质体表观形貌的影响,结果发现包埋叶黄素、β-胡萝卜素和番茄红素的脂质体平均粒径在60~80nm之间,囊泡呈规则的球形,体系分散均一,而斑蝥黄素脂质体粒径很大、体系中有聚集的囊泡。运用溶剂萃取法并结合可见分光光度法分析对比脂质体对该四种类胡萝卜素的包埋能力,通过比较脂质体中类胡萝卜素的包封率及载量,发现类胡萝卜素载入脂质体双分子层的能力由强至弱依次为叶黄素β-胡萝卜素番茄红素斑蝥黄素。贮藏实验表明,在低温贮存18天的过程中,β-胡萝卜素和叶黄素的载入不仅有效减缓了脂质体平均粒径的增加,而且保留率也分别在60%和75%以上。番茄红素和斑蝥黄素脂质体的贮藏稳定性较差,高载量时有超过50%被包埋的芯材泄漏。此外,β-胡萝卜素和叶黄素的载入可以有效抑制脂质体囊泡在受热过程中的聚集融合,而番茄红素和斑蝥黄素的作用则相反。 采用荧光探针、激光共聚焦拉曼光谱、电子自旋共振等技术手段,从脂质体双分子层流动性和结构特性这一角度分析类胡萝卜素脂质体的稳定性机理。对比发现番茄红素和斑蝥黄素分别在0.25%~1.0%和0.25%~0.5%载量范围内对脂质膜流动性影响较小,而在更高载量时扰乱了脂质分子的有序性排列,降低了脂质体双分子层的微粘度,进而破坏了脂质体的稳定性;而叶黄素和β-胡萝卜素对脂质体的脂质双分子层有明显的“固化”作用,降低了膜流动性,因而保持了贮藏和加热过程中脂质体的稳定性。 分析类胡萝卜素在不同介质环境中(混悬液和脂质体)的抗氧化能力,探索类胡萝卜素在脂质体双分子层中发挥抗氧化活性的机理及影响因素。与类胡萝卜素混悬液相比,脂质体作为载体能显著改善类胡萝卜素清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的能力和还原能力。除了自身的化学活性,类胡萝卜素在脂质体脂质双分子层内的定位(即与氧化物的作用位点)直接影响其在脂质膜内的抗氧化能力。通过测定硫代巴比妥酸反应物(TBARS),考察类胡萝卜素在脂质体制备过程、Fe3+/Vc诱导以及磷脂自氧化三种环境下抑制脂质过氧化的能力。结果表明,适量的番茄红素和斑蝥黄素能在脂质体双分子层内发挥有效的抑制脂质过氧化作用,而在高载量时抗氧化作用降低,甚至表现为促氧化作用;β-胡萝卜素和叶黄素在所研究载量范围内在脂质体中能发挥很强的抑制脂质过氧化作用。同时还发现,抗脂质过氧化作用与类胡萝卜素的保留率呈现正相关性,这表明脂质体和类胡萝卜素之间有协同保护效应。 通过构建体外消化模型,监控类胡萝卜素脂质体在模拟胃肠液中的形貌变化、磷脂水解程度和芯材的释放行为。动态光散射和原子力显微图像发现,在胃肠液中叶黄素和β-胡萝卜素脂质体相比番茄红素和斑蝥黄素脂质体有更窄的粒径分布和更规则的超微形态。在消化过程中β-胡萝卜素和叶黄素持续、缓慢地释放,肠液消化结束后释放率分别低于45%和55%;番茄红素和斑蝥黄素则经历快速、大量的释放,消化结束后释放率分别达到65%和80%。类胡萝卜素的生物可给率按叶黄素β-胡萝卜素番茄红素斑蝥黄素顺序递减,随载量的提高,各类胡萝卜素的生物可给率均有不同程度的降低。进一步运用相关性分析发现,类胡萝卜素的生物可给率受其载入双分子层的能力和脂质体载体理化特性的影响。 通过测定壳聚糖-稀酸溶液的的表面张力、荧光特性及表观粘度,考察壳聚糖在稀酸溶液中的自聚集现象。研究发现,当浓度高于1mg/mL时,壳聚糖舒展分子链逐渐自聚集形成卷曲分子链,随浓度进一步提高,形成无规线圈和堆叠线圈结构。采用浊度法、动态光散射以及原子力显微镜等研究手段,发现当壳聚糖为分子链构象时主要通过静电引力平坦吸附于脂质体表面,形成约10nm的包覆层;而壳聚糖无规线圈与脂质体的相互作用力受疏水相互作用和静电作用共同控制。运用荧光探针、电子自旋共振、拉曼光谱技术,进一步考察壳聚糖包覆对脂质体流动性及结构的影响。结果显示,壳聚糖分子链形成的包覆层不仅为脂质体表面提供亲水屏障抑制脂质囊泡间的聚集融合,而且降低了脂质膜的流动性,增强了脂质分子间碳链的有序排列。相比于舒展分子链,壳聚糖卷曲分子链的稳定性作用更为明显。然而,壳聚糖线圈表现出典型的聚合物表面活性剂特征,可以渗透进入脂质体双分子层内部,破坏磷脂分子的有序堆积,增大膜流动性和通透性。 采用呈分子链构象的壳聚糖(浓度范围0.5~1.5mg/mL)包覆类胡萝卜素脂质体,验证其提高类胡萝卜素稳定性的作用。透射电镜图像和动态光散射显示,形成的壳聚糖-类胡萝卜素脂质体纳米复合物具有典型的核-壳结构,平均粒径150nm,zeta电位在10~20mV之间。此外,壳聚糖包覆提高了脂质体对类胡萝卜素的包埋能力,并显著增强了类胡萝卜素对光、热和胃肠道环境的耐受性。


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