底物供应对产油酵母Yarrowia lipolytica油脂积累影响机制

【摘要】：产油微生物可以在细胞内积累大量的油脂，其独特的培养特性和代谢途径使其可以用来生产功能性脂肪酸以及作为生物柴油的原料。耶氏解脂酵母是产油微生物的一种，可以在细胞内积累占细胞干重36%的油脂，并且能够利用多种碳源作为其积累油脂的原料（如烷烃类物质，脂肪酸，乙醇，乙酸，葡萄糖，果糖和甘油等）。耶氏解脂酵母的基因组信息已经公布，拥有完善的遗传改造工具，目前主要作为细胞工厂用于合成功能性油脂，如二十碳五烯酸和共轭亚油酸等，具有较好的工业应用价值。然而和其它产油酵母相比，耶氏解脂酵母细胞内的油脂含量较低，且大部分的野生型菌株都不能在细胞内积累较多油脂，其油脂积累机制还有待探索。因此，本研究将从提高细胞内脂肪酸合成过程所需要的底物还原力NADPH和乙酰辅酶A的供应两个方面来探索耶氏解脂酵母油脂积累的机制，以期提高细胞内油脂积累，并为其商业化生产提供理论基础。本文的主要研究结果如下： （1）苹果酸酶酶学性质及其与油脂积累的相关性研究 将来自耶氏解脂酵母的苹果酸酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，通过镍柱纯化得到苹果酸酶重组蛋白质，并对其酶学性质进行分析，发现耶氏解脂酵母苹果酸酶能够以NAD+或者NADP+作为其辅酶参与酶促反应，而苹果酸酶对NADP+的亲和力（Km为3.9mM）远远低于对NAD+的亲和力（Km值为0.63mM）。耶氏解脂酵母苹果酸酶在生理状态下NADP+依赖型的酶活性很低，并且亚细胞定位分析显示其定位于线粒体，并不能为发生在细胞质的油脂积累过程提供还原力NADPH。另外，将来源于另外一种产油真菌高山被孢霉中定位于细胞质的苹果酸酶基因通过质粒pINA1312-mce2导入耶氏解脂酵母的基因组中并成功表达，重组菌株细胞中NADP+依赖型苹果酸酶活性从0.5U/mg提高到338U/mg，但是细胞内的油脂含量没有提高，依然维持在细胞干重的8%左右。因此，苹果酸酶不能为油脂积累过程提供还原力NADPH，其不是耶氏解脂酵母油脂积累的限制性因素。 （2）其它NADPH产生酶与油脂积累的相关性研究 耶氏解脂酵母还存在另外三种产生还原力NADPH的酶，分别是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）和NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶（NADP-ICDH），因此将这三种酶分别在耶氏解脂酵母细胞中过表达，酵母细胞内三种酶的活性显著提高，重组菌株中G6PD、6PGD和NADP-ICDH的活性最大分别为3104U/mg、946U/mg和2324U/mg，与对照菌株相比分别提高了5倍、3倍和4倍。三个还原力产生酶的过表达对耶氏解脂酵母的生物量、油脂含量和脂肪酸组成的影响均不显著，耶氏解脂酵母还原力NADPH供应增加并没有增加细胞内油脂含量。因此，在低产脂耶氏解脂酵母菌株中，还原力NADPH的供应并不是油脂积累的限制性因素。 （3）耶氏解脂酵母代谢流分析 耶氏解脂酵母在高氮和低氮培养基中培养时，其细胞积累的油脂含量分别是8.7%和14.3%，基于13C标记葡萄糖的对其代谢流分析结果显示，两种培养条件下均没有发现乙醛酸支路和NADP+依赖型苹果酸酶的活性，在高氮培养条件下磷酸戊糖途径和NADP+依赖异柠檬酸脱氢酶的活性比低氮培养条件下更低，因此，还原力NADPH并不是耶氏解脂酵母油脂积累过程的限制性因素。同时还发现在高氮培养条件下，基本没有ATP柠檬酸裂解酶的活性，而在低氮培养条件下，ATP柠檬酸裂解酶的活性显著提高，可为油脂积累提供更多乙酰辅酶A，因此ATP柠檬酸裂解酶可能是耶氏解脂酵母油脂积累的限制性因素。 （4）ATP柠檬酸裂解酶与脂质积累相关性研究 根据第三章的结果，将来自小鼠的ATP柠檬酸裂解酶（对柠檬酸的亲和力较高，Km值为0.05mM，）基因导入耶氏解脂酵母的基因组中，Western bloting和体外活性检测显示小鼠的ATP柠檬酸裂解酶成功表达，且细胞内ATP柠檬酸裂解酶的活性显著提高，重组酵母细胞内油脂含量在11-23%之间，与对照菌株相比油脂含量显著提高，且多拷贝整合的转化子比单拷贝整合的转化子油脂含量更高，并且油脂含量与ATP柠檬酸裂解酶基因的拷贝数相一致。油脂含量最高的菌株为YL-1292-ACL-6，其油脂含量为23%，比对照菌株提高了2倍，同时酵母细胞分泌的柠檬酸含量从4.0g/L下降到3.2g/L。因此在低产脂耶氏解脂酵母菌株中，乙酰辅酶A的供应可能是耶氏解脂酵母油脂积累的关键性因素。