棉籽球蛋白热聚集行为及其凝胶特性研究

【摘要】：棉籽蛋白不仅是一种重要的饲料添加剂,也是一种优质的膳食蛋白资源。但目前棉籽蛋白资源开发利用不是很充分,因此研究开发棉籽蛋白资源具有重要意义和应用价值。本论文旨在研究棉籽球蛋白在热处理下的聚集行为、聚集体结构及其对凝胶特性的影响,为深入理解棉籽蛋白改性机制和将棉籽蛋白聚集体应用于食品工业提供了理论依据。本论文的主要结论如下:首先确定了棉籽分离蛋白及其主要组分7S、12S球蛋白的分离提取方法。运用响应面分析法优化了棉籽分离蛋白提取工艺,在优化提取工艺条件下,蛋白质提取率为58.2%,蛋白纯度为91.28%,棉酚残留为0.023%;7S及12S球蛋白可采用Superdux 200 10/300GL凝胶柱层析获得。该方法制备的7S及12S蛋白质的含量分别为90.26±1.26%和94.50±0.73%(N×6.25)。制备所得样品经聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明纯度较高,可用于后续研究。氨基酸分析表明,棉籽分离蛋白(CPI)含有人体所需的各种必需氨基酸。从其组成来看,碱性氨基酸(Lys、Arg和His)含量低于酸性氨基酸(Asp和Glu),属于酸性蛋白质。采用表面荧光探针(ANS)法检测CPI及7S、12S的表面疏水性指数(S0)分别为126.41,91.60和142.73;差示扫描量热仪(DSC)法测得热变性温度分别为94.34℃、96.27℃和103.7℃;5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法测得CPI的游离巯基(SHF)、总巯基(SHT)和二硫键(-S-S-)含量为11.84、98.27和43.21μmol/g蛋白质;7S的为6.37、82.04和37.84μmol/g蛋白质;12S的为8.49、98.31和44.91μmol/g蛋白质;根据ζ-电位法分析出CPI及7S、12S的等电点分别为4.8、4.2、4.2;三者的荧光发射光谱最大荧光强度都在325 nm左右;CPI及7S、12S的溶解度均在酸性条件下较高,而在中性及弱酸性条件下较低,三者均在其等电点附件有最低的溶解度。在pH3.0-7.0范围内,蛋白质浓度12%是棉籽分离蛋白的最低凝胶点。蛋白浓度、pH及盐离子浓度对棉籽分离蛋白凝胶特性有较大的影响。棉籽蛋白浓度为16%时,凝胶的硬度最大;浓度为14%时,弹性和粘附性均达到最大值;在酸性条件下,棉籽分离蛋白比在碱性条件下更容易生成凝胶。pH 3.8时凝胶硬度和弹性达到最大,粘附性在pH5.2时达到最大。同时,pH值是影响棉籽蛋白凝胶微观结构的主要因素。不同pH的凝胶,其结构具有较大的差异。在酸性条件下(pH3.8、5.2),凝胶网络结构分布均匀且致密,在中性条件下,凝胶网络结构较为粗糙,分布均匀性下降;盐浓度对凝胶网络结构的类型没有太大的影响,但对凝胶的硬度和弹性有着显著的影响,当盐浓度为0.2mol/L时,棉籽分离蛋白形成凝胶的硬度和弹性均比较高。中性条件下(pH7.0)的热处理诱导了棉籽7S及12S球蛋白发生聚集,采用小角X光散射等技术表征了热聚集过程中的蛋白结构变化,明确了7S蛋白在中性条件下形成的热聚集体仍然呈现类似球状的形态,而12S球蛋白热处理后形成了更大尺度的聚集体,但形态和粒径则较不均一。分析聚集体的溶解度发现,虽然CPI、7S及12S球蛋白在大于其热变性温度的热处理下均发生表面疏水性提高,表面电荷减小,溶解度减小的现象,但相对来说,7S蛋白依然保持了较高的溶解度,可认为其生成的为可溶性聚集体,而12S球蛋白在热变性后生成的聚集体则表现为溶解度急剧下降,可认为生成的是不可溶性聚集体。通过对聚集体混合溶液的流变学实验分析发现,可溶性聚集体的比例对蛋白浓溶液的剪切黏度具有较大的影响,比例越大,剪切黏度越低。通过凝胶流变性和质构分析,发现可溶性聚集体与不可溶性聚集体的比例对凝胶的形成、凝胶特性及其微观结构均有较大的影响,当7S与12S热聚集体比例为2:1时,加热后可形成凝胶,并且凝胶速度较棉籽分离蛋白有所提高。当7S与12S热聚集体比例为1:1和1:2时则无法形成凝胶;凝胶中可溶性聚集体含量越高,其硬度和弹性都更好,且其微观结构也更加细腻,颗粒度小,分布均匀。酸性条件下(pH 2.0)的热处理诱导了棉籽7S及12S球蛋白发生聚集,系统研究了7S和12S球蛋白的水解过程、结构变化和纤维聚集体的形成及形貌特征。发现在同等条件下,7S可生成纤维状聚集体,且其聚集是有限的;而12S生成无定形聚集体,且其聚集是无限的。通过流变学分析发现,纤维状聚集体对溶液的剪切黏度有较大的影响,含量越高,剪切黏度则越高;同时,纤维状聚集体对棉籽蛋白凝胶凝胶特性及其微观结构均有较大的影响。纤维状聚集体比例越高,形成凝胶的速度越快,凝胶越均匀,空隙越小,越为细腻。