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冰川低温酯酶产生菌的选育、基因克隆表达及在奶味香基制备中的应用

董娟  
【摘要】:低温酯酶在低温下具有高催化活性,使其在食品、洗涤和环境保护等工业领域有着更大的应用潜力。酯酶能酶解奶油产生奶酪特有香气的中、短碳链脂肪酸,可用于奶制品香精基料的开发。冰川环境是较少受到人类活动影响的开放性系统,蕴藏着丰富的低温微生物及酶资源,近年来由于全球气候变暖,冰川持续消融和退缩,使得开发其资源刻不容缓,目前成为极端微生物研究的热点之一。本论文依托新疆天山1号冰川资源,筛选能水解奶油产生中、短碳链脂肪酸的低温酯酶产生菌,通过常温常压等离子体(ARTP)诱变、基因工程等技术手段提高酶的产量,并进一步探讨酯酶酶解稀奶油的工艺及参数,同时利用现代食品风味分析手段对比分析并鉴定奶制品原料、低温酯酶酶解产物、自制奶味香精及市售牛奶香精的挥发性风味物质,为开发新型低温酯酶酶制剂提供重要的理论依据。主要研究内容及结果如下:(1)从采自天山1号冰川沉积层的土样和冰川融水样中,分离出377株可培养细菌,通过重复序列PCR(rep-PCR)技术鉴定后,最终选取了61株菌落形态特征差异较大的菌株进行革兰氏染色、细胞和形态特性的研究,并通过3种选择培养基进行初筛,其中有10株菌在三丁酸甘油酯平板上出现较大透明圈,再通过酯酶活性测定确定出5株产酯酶能力较强的细菌,其中T1-39分解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)活力最强为8.96U/mL。同时对这5株产酯酶菌株的菌落形态、生理生化特征及分子生物学特性进行了分析鉴定,其中,菌株T1-39被鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.),命名为Pseudomonas sp.T1-39,其16S r RNA基因序列的GenBank登录号为KP780205。(2)研究了ARTP快速诱变菌株Pseudomonas sp.T1-39,并结合三丁酸甘油酯平板及pNPB酶活测定法进行筛选,获得TB1、TB11、D3三株酶活较高的正突变菌株,通过遗传稳定性及生长规律的研究,确定了1株遗传稳定性好、增殖速率快的菌株TB11进行发酵产酶,其酶活力比原始菌株提高了3.45倍。通过培养基成分及发酵条件的确定,得出突变株Pseudomonas sp.TB11产酯酶工艺为:以稀奶油为诱导剂,胰蛋白胨和硫酸铵为氮源,添加2%的PVA,初始pH 9.0,发酵温度15℃,2%的接种量,装液量20 mL/250mL,200 rpm的摇床转速下,发酵32 h,得到的酯酶命名为Est TB11,酶活力为58.92U/mL,是优化前的1.48倍,是原始菌株Pseudomonas sp.T1-39酯酶的6.58倍。(3)采用硫酸铵沉淀、Q Sepharose FF离子层析和Superdex G75凝胶过滤层析对酯酶Est TB11进行了分离纯化,并在此基础上,对酯酶蛋白的相对分子质量、肽指纹图谱及N-端氨基酸序列进行了分析鉴定,采用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(5800MALDI-TOF/TOF)确定酯酶蛋白的相对分子质量为64.601 kDa,N-端的10个氨基酸序列为GVYDYKNLTT。进一步探讨了纯化后酯酶的酶学性质,得出最适酶反应pH为8.5,且在pH7.0~10.0的范围内有较好的稳定性,最适温度为25℃,因此,在低温条件下占有较好的优势。而且,EstTB11在15℃~35℃范围内较稳定,保温720 min时,在15℃~25℃下持有约90%的残余酶活,在35℃下约有80%的残余酶活。45℃保温60 min仍可保持约65%的相对酶活,表现出较高的热稳定性。同时研究表明,酯酶EstTB11在以p-NPB和p-NPC(C4~C5)为底物时表现较高的酶活,可见该酯酶对中、短碳链酯具有较好的催化作用,这也进一步阐释了该酯酶在食品工业及奶制品增香方面具有潜在的应用价值。(4)研究了低温酯酶Est TB11基因的克隆表达、重组蛋白的纯化及性质。通过染色体步移技术并结合Est TB11酯酶的氮端氨基酸序列,从Pseudomonas sp.TB11基因组扩增得到一段长为1848 bp的开放阅读框,编码615个氨基酸,并预测了酯酶的二级和三级结构;再通过构建重组表达载体,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,测得酶活力为10.67 U/mL,是原始菌株酶活的1.19倍,但与突变株酶活相比偏低,大部分表达蛋白以包涵体形式存在。表达后的蛋白通过镍离子亲和层析、透析获得的重组蛋白restT复性成功,且该蛋白对中、短碳链的酯水解能力较强,其水解pNPB的比活力为195.03U/mg;进一步研究了重组酯酶的酶学特性,结果表明rest T最适作用温度为20℃左右,最适pH为8.5,在终浓度为5 mmol/L的K+、Ba2+和Na+存在下对其有激活作用。(5)采用SPME-GC/MS和电子鼻检测技术分析了稀奶油、酯酶restT酶解物、诺维信Palatase 20000L酶解物及两种商品牛奶香精的挥发性化合物,并对香气相似性进行了比较。通过两种酶酶解工艺及酶解产物GC/MS图谱的对比分析,表明低温酯酶rest T在较低温度下,甚至是4℃时具有较好的水解能力,能最大程度的保留酶解产物香气组分,使获得的奶香更加逼真;并采用电子鼻检测技术对8种不同样品进行处理,通过雷达指纹图谱分析、PCA主成分分析及DFA数据分析,结果均表明,与酶解产物、商品牛奶香精相比,自制天然奶味香精与稀奶油、纯牛奶原料的相似度更高,更接近于天然奶香味且区别于合成牛奶香精,为开发新型低温酯酶酶制剂提供了重要的理论依据。同时,也进一步表明电子鼻技术可以辅助SPME-GC/MS分析技术,能够迅速评价样品的香气品质。


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