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嗜酸热硫化叶菌MTSase和MTHase的异源表达及应用

吴世雄  
【摘要】:海藻糖是一种安全、可靠的非还原性二糖,广泛存在于自然界中。海藻糖性质稳定,对生物体或生物大分子具有优良的抗逆保护作用,这些独特的生物功能和理化性质,使其在医药、食品、农业等多种行业应用前景广阔。麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)是以淀粉为原料制备海藻糖的关键酶。本研究首先将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)ATCC 33909的MTSase和MTHase在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组表达,考察了重组酶的酶学性质;进而对重组E.coli进行了3L罐发酵条件优化。首次将该酶在短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中进行了重组表达,在摇瓶发酵的基础上进行了3L罐放大试验。在此基础上,研究了不同酶转化条件对海藻糖转化率的影响。主要研究结果如下:(1)构建了重组表达S.acidocaldarius ATCC 33909 MTSase和MTHase的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-treY、E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-tre Z,研究了提高重组蛋白可溶性表达的不同方法和策略,构建基因工程菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY、E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treZ,发现将MTSase和MTHase分别与硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)进行融合表达时,融合酶Trx-MTSase和Trx-MTHase的酶活分别为41.0 U?m L-1和42.0 U?m L-1,分别为非融合表达时酶活力的1.7倍和4.0倍(MTSase 24.2 U?mL-1,MTHase 10.4 U?mL-1)。切除N-端Trx蛋白后,MTSase和MTHase酶活都不同程度的提高,分别为切除前的1.26倍和1.31倍,为非融合表达时酶活的2.1倍和5.2倍。(2)对重组酶进行分离纯化和酶学性质研究,结果表明:(1)MTSase、MTHase的最适温度均为75℃。MTSase和MTHase在60℃半衰期分别为6 d和8 d,在75℃半衰期分别为12 h和16 h。(2)MTSase和MTHase的最适pH分别为5.5和6.0,MTSase在pH 5.0-5.5相对酶活维持在96%以上,MTHase在pH 5.5-6.0相对酶活维持在95%以上;pH稳定性结果表明MTSase和MTHase pH稳定性基本一致,均为pH 5.0-9.5。(3)对重组菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY、E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treZ 3L罐发酵诱导条件进行优化,结果表明:(1)在重组菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY发酵过程中,以30℃恒温培养,OD600达到40时,以流速0.4 g?L-1?h-1恒速流加乳糖进行诱导,诱导24 h,重组酶MTSase酶活最高达到229.0U·m L-1,约为摇瓶发酵酶活的5.6倍;(2)在重组菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treZ发酵过程中,以30℃恒温培养,OD600达到40时,以流速0.2 g?L-1?h-1恒速流加乳糖进行诱导,诱导24 h,重组酶MTHase酶活最高达到204.0 U·m L-1,约为摇瓶发酵的4.9倍。(4)首次将S.acidocaldarius ATCC 33909 MTSase和MTHase在B.brevis中进行了重组表达,构建基因工程菌B.brevis/pSVN-treY和B.brevis/pSVN-tre Z。重组菌在TM培养基中30℃摇瓶发酵60 h,胞内酶活力分别达到MTSase 16.3 U?m L-1、MTHase 7.8U?m L-1。重组菌3 L罐放大培养,MTSase和MTHase酶活分别达到66.0 U?m L-1和36.0U?m L-1,分别为摇瓶的4.0倍和4.6倍。(5)对重组MTSase和MTHase制备海藻糖工艺进行了研究,确定了实验室条件下双酶法生产海藻糖的最佳条件:以10%(w/v)马铃薯淀粉为底物,酶转化温度为60℃,pH 5.5,加酶量为MTSase 80 U?g-1淀粉、MTHase 20 U?g-1淀粉和普鲁兰酶5 U?g-1淀粉,反应48 h,海藻糖转化率达到最高为78.8%。底物浓度为25%时,海藻糖转化率为74.2%,产量为185.5g?L-1;底物浓度为30%时,海藻糖转化率只有68.4%,但产量达到最高的205.2 g?L-1。因此从工业生产角度考虑,选择底物浓度为25%-30%时为最佳。


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