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基于ARTP诱变、表达元件定向改造及发酵优化提高枯草芽孢杆菌生产重组碱性淀粉酶的水平

马樱芳  
【摘要】:碱性淀粉酶是重要的工业酶制剂之一,能够在碱性环境中维持稳定并保持高效的催化活性,广泛应用于纺织、造纸及洗涤剂配方等多个工业领域,具有广阔的市场前景。目前,碱性淀粉酶的生产主要集中于野生型嗜碱微生物的筛选、高产突变株的诱变筛选及酶的异源表达等方面。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是遗传背景较为清晰的革兰氏阳性菌株,具有较强的蛋白分泌能力、易于培养等多种优点,是工业酶制剂理想的表达宿主之一。本研究通过对生产碱性淀粉酶的重组B.subtilis菌株进行常压室温等离子体(ARTP)诱变及筛选,对高产突变株进行发酵优化以提高其产量。在此基础上,进一步筛选并定向改造适合碱性淀粉酶分泌表达的B.subtilis信号肽和启动子。本研究的主要内容如下:(1)基于ARTP诱变和高通量筛选技术,采用先诱变构建突变宿主文库后转化重组质粒构建重组突变库的方式,以B.subtilis WB600为出发菌株,获得一株可用于高效表达碱性淀粉酶的突变体B.subtilis WB600M,其碱性淀粉酶酶活提高了35.0%,且具有较好的遗传稳定性。(2)通过比较与分析,最终确定宿主B.subtilis 168更适合表达重组碱性淀粉酶。以含有碱性淀粉酶重组质粒的B.subtilis 168为出发菌株,通过直接诱变筛选的方式,快速获得一株突变株B.subtilis 168 mut-16#,其产量较出发株提高31.4%且遗传稳定。(3)采用单因素叠加法和正交试验对突变株B.subtilis 168 mut-16#的培养条件及培养基进行了优化。优化后,碱性淀粉酶酶活力达369.3 U·m L-1,是优化前的128.8%。在3 L发酵罐水平,对搅拌转速、培养基浓度及补料组分和方式分别进行优化,最高酶活力达591.5 U·m L-1,相应最适发酵条件:550 r·min-1、2倍碳氮源浓度、发酵10 h时间歇补加终浓度为2.0%的液化淀粉。(4)筛选确定最适产碱性淀粉酶的信号肽为YwbN(M1)。删除信号肽M1后一段长57 bp的假定蛋白序列后,碱性淀粉酶酶活力达538.1 U·m L-1,提高为删除前的1.5倍。对改造后的信号肽M11,进一步采用定点突变技术增加N端正电荷数目,碱性淀粉酶产量达到624.3 U·m L-1。在此基础上,继续增加H区极性氨基酸数目,将16、17、19位非极性氨基酸I、L、W相应突变为极性氨基酸N、S、S,降低信号肽H区疏水性后,碱性淀粉酶产量显著提高,达到983.8 U·m L-1。(5)比较了启动子PHpa II、启动子P43、启动子串联PHpaII-PHpa II、P43-PHpaII对碱性淀粉酶表达的影响,确定启动子PHpa II更适合amyK基因的表达。进一步对启动子PHpaII的-10区和-35区间隔序列长度进行定向改造,删除启动子-27位碱基T、-31位碱基A后,碱性淀粉酶产量较突变前分别提高了23.3%和15.0%,达到1213.1 U·m L-1和1131.2U·m L-1。采用半定量RT-PCR技术验证了突变后酶活力提高的原因。基于前期优化的发酵条件,突变株B.subtilis PM2的碱性淀粉酶产量可达1361.0 U·mL-1。


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