燕麦抗冻蛋白的分离纯化及对冻藏面团品质的影响

【摘要】：抗冻蛋白(AFP)是一种对冰晶的生长和重结晶有抑制作用的特殊蛋白质,具有热滞效应(THA)、抑制重结晶效应(RI)、修饰冰晶形态效应三个基本特征。由于其具有阻止冰晶生长、抑制冰晶重结晶而使生命有机体免受结冰破坏的特点,AFPs有望在冷冻食品的保鲜方面发挥重大作用,成为一种有前景的冷冻食品添加剂。本文从冷诱导的燕麦籽粒中分离纯化得到一种新型的植物抗冻蛋白(AsAFP),经序列鉴定后对其性质进行预测与分析;利用同源建模对AsAFP进行三维结构的模建,对AsAFP和冰晶面复合物进行分子动力学模拟,通过分子模拟技术分析其抗冻机理,为抗冻蛋白的研究实验提供了理论指导;并将AsAFPs应用于冷冻面团及湿面筋蛋白中,对冻藏过程中冷冻面团的理化特性和最终馒头制品的质构,以及湿面筋蛋白的聚集行为、冻融特性、理化特性等进行了研究。论文首先从冷诱导的燕麦籽粒中经过一系列的分离纯化步骤,得到电泳纯的AsAFP,热滞活性为1.24°C,通过MALDI-TOF-MS/MS法进行序列鉴定,并对其氨基酸组成、等电点及相对分子质量、二级结构及表面溶剂可及性等进行了预测和分析。结果表明:AsAFP的氨基酸序列为VSSVISSSLF EKMLLHRGFY TYDAFIAAAK SFPAFATTGS TDVRKREVAA FLAQTSHETT GGWPTAPDGP YELGSTSDYF GRGPIQISYN YNYGAAGKAI GVDLLRNPDL VTSDNTVEFK TALWFWMTPQ SPKPSSHDVI TGRWSPSSTD KAAGRVPGYG VLTNIIDGGV ECGKGQESHV ADRIGYYKDN LDCYNQKPFA,与Endochitinase具有最大匹配度;AsAFP具有高亲水性氨基酸残基比例;其理论等电点为6.08,相对分子质量为21728.18;二级结构中含有大量的无规则结构,富含α-螺旋结构,且具有较高的表面溶剂可及性。以AsAFP氨基酸序列为探针,对AsAFP进行同源建模,将模建的蛋白与不同冰晶面进行对接,计算结合能量,并对AsAFP和冰晶层复合物进行分子动力学模拟。4DWX被认为是AsAFP的同源建模最佳模板,序列一致性达63%,序列覆盖度达100%;以4DWX的三维结构为模板,采用modeller 9.14单模板建模并进行结构优化,构建出准确性较高的AsAFP模型;以分子对接方法预测AsAFP和冰晶层复合物的结合模型,对接结果的分析发现,AsAFP的遥爪结构(由Helix和loop组成)是其与冰晶结合的主要位点,氢键作用和疏水相互作用在AsAFP和冰晶层的稳定结合中起到关键的作用,Asn、Arg和Ser等氨基酸残基参与形成氢键;对AsAFP和冰晶层复合物进行分子动力学模拟,分子动力学数据表明,AsAFP和冰晶层在动力学模拟过程中表现出很好的稳定性,随着时间的推移,回转半径、氢键数量、二级结构和溶剂可及表面保持平衡,进一步说明了AsAFP-冰晶层复合物结合的紧密;由于AsAFP与Prism型晶面在动力学模拟过程中产生的氢键数量最大,结合稳定性最优,使其表现出的抗冻性更高。将AsAFPs添加到冷冻面团中,研究了冻藏过程中AsAFPs对冷冻面团的影响。研究表明:冻藏过程引起了面团体系可冻结水含量的增加,而AsAFPs的亲水性使其可以吸附在自由水附近,限制水分的自由移动,从而显著减缓可冻结水含量增加的幅度,而可冻结水含量决定了面团在冻藏过程中冰晶形成的数量,因此AsAFPs可以有效抑制冻藏过程中面团体系冰晶的形成;AsAFPs的存在可以降低面团水分流动性,抑制冻藏过程中强结合水的流失;降低冻藏过程中冷冻面团G'和G'的下降趋势,增强冷冻面团的产气和持气能力,提高酵母菌的存活率,保护面筋网络结构;提高馒头最终品质,使馒头制品更柔软,提高馒头制品的黏聚性和回弹性。将AsAFPs添加到面筋蛋白中,研究了冻藏过程中AsAFPs对面筋蛋白的影响。对面筋蛋白、麦谷蛋白、麦醇溶蛋白聚集行为的研究表明:冻藏过程中,面筋蛋白和麦谷蛋白中的GMP随着冻藏时间的延长发生了不同程度的解聚,麦醇溶蛋白分子量分布范围发生改变。AsAFPs的加入可以通过抑制冰晶形成和重结晶,减少冻结及冻藏对面筋网络的破坏,保护面筋蛋白在冻藏过程中免受冰晶形成所造成的机械破坏,从而减缓面筋蛋白和麦谷蛋白的解聚,减小麦醇溶蛋白在冻藏过程中造成的机械损伤;SDS-PAGE电泳研究发现,冻藏对还原后的面筋蛋白和麦谷蛋白亚基并无影响;但面筋蛋白、麦谷蛋白、麦醇溶蛋白的自由巯基含量均有所增加,可见冻藏过程中二硫键的断裂是导致高聚物发生解聚的主要原因。AsAFPs的添加可以减少二硫键的断裂,降低自由巯基含量的增加。对面筋蛋白冻融特性的研究表明:对新鲜面筋蛋白而言,AsAFPs的添加可以增大面筋蛋白的熔融温度区间,降低面筋蛋白样品的熔融焓和可冻结水含量,提高玻璃化转变温度;而对于冷冻面筋蛋白,AsAFPs的添加可以降低水分流动性、熔融焓和可冻结水含量;对面筋蛋白流变学性质、二级结构和微观性质的研究表明:AsAFPs可以减缓冻藏过程中冷冻面筋蛋白G'和G'的下降趋势,保护面筋蛋白的α-螺旋和β-折叠结构免受冰晶损伤,保护面筋网络结构。