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大肠杆菌脂多糖分子的核心多糖结构变化对细胞膜及胞内代谢的影响

王洲  
【摘要】:脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞外膜的主要组分,由类脂A、核心多糖和O-抗原重复单元三部分组成。LPS一方面能保护细菌抵御恶劣环境和有害物质,另一方面,在细菌侵染宿主后会引起免疫反应。与类脂A和O-抗原相比,关于核心多糖的研究较少。为了解LPS核心多糖结构的功能及对细胞的重要性,本课题以大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株W3110为出发菌,通过染色体无痕基因敲除,构建了一系列LPS核心多糖突变菌株,并对各菌株的细胞膜壁结构、细胞内代谢变化以及细胞间相互作用进行系统分析,揭示了核心多糖的结构对细菌细胞的重要性。主要结论如下:(1)通过染色体基因无痕敲除手段,构建了一系列E.coli LPS核心多糖突变菌株。根据E.coli K12菌株W3110中LPS核心多糖的合成途径,对核心多糖合成基因簇进行分析,确定与核心多糖合成相关的10种糖基转移酶及磷酸转移酶,利用Red重组敲除技术,分别对这10个编码基因进行敲除,构建了E.coli LPS核心多糖突变菌株ΔwaaC、ΔwaaF、ΔwaaG、ΔwaaO、ΔwaaR、ΔwaaU、ΔwaaP、ΔwaaQ、ΔwaaY和ΔwaaB。通过对突变菌株及其回补菌株的脂多糖分子结构鉴定,确认这些突变菌株合成的LPS含有不同核心多糖结构。通过类脂A提取和鉴定,明确菌株核心多糖的结构改变对类脂A的合成没有产生影响。通过测定菌株生长曲线,结果表明,核心多糖结构突变菌株在12小时内的生长快于野生型W3110。(2)核心多糖的结构变化会引起细胞外膜渗透性、鞭毛以及细菌荚膜多糖合成的改变。对突变菌株外膜渗透性的研究发现,核心多糖缺失引起外膜渗透性和抗生素敏感性的增强。通过透射电镜观察发现,核心多糖结构变化引起大肠杆菌细胞表面鞭毛的缺失,结合鞭毛合成基因表达水平分析,结果表明,鞭毛合成转录因子FliA及鞭毛丝蛋白FliC编码基因表达强度明显下调。在突变菌株平板培养过程中发现,庚糖基转移酶II突变菌株ΔwaaF在37℃条件下表现出特异的粘液化突变。以岩藻糖为目标产物,对菌株荚膜多糖含量进行测定,结果表明,ΔwaaF突变菌株的岩藻糖含量为3.48 mg/L,野生型为1.12 mg/L,突变菌株为野生型的3.1倍。结合荚膜多糖合成途径基因的转录水平分析,发现突变菌株岩藻糖合成途径中cpsG,cps B基因转录水平明显上调,分别为野生型的3.79倍和5.29倍,荚膜多糖装配及转运蛋白相关基因wcaJ和wza的转录也有上调表现。(3)核心多糖结构变化会引起细胞内糖代谢改变和PHB的胞内积累。对大肠杆菌的发酵分析,结果表明,核心多糖结构变化会增加胞内蛋白质的含量,从而提高菌体的生物量水平。同时,对发酵p H、葡萄糖利用以及氨基酸胞外分泌没有明显改变。对胞内氨基酸的合成,会引起酪氨酸和赖氨酸合成代谢的改变。在大肠杆菌各菌株中转入表达质粒pBHR68进行PHB的合成,发现相对于野生型W3110,核心多糖结构变化会增加PHB在胞内的积累,ΔwaaC、ΔwaaF、ΔwaaG、ΔwaaU、ΔwaaP和ΔwaaY突变菌株胞内均有明显的PHB颗粒,其中重组菌ΔwaaU/pBHR68的PHB产物比重为64.3%,ΔwaaY/pBHR68为65.1%,相比对照重组菌W3110/pBHR68的含量提高60%以上。对PHB发酵参数分析,同样表现出菌体生物量增加,同时,在葡萄糖利用方面,各菌株表现明显差异,主要表现为,相对于重组野生型菌株W3110/pBHR68,重组菌ΔwaaC/pBHR68、ΔwaaG/pBHR68和ΔwaaP/pBHR68表现糖耗降低,而ΔwaaF/pBHR68、ΔwaaU/pBHR68和ΔwaaY/pBHR68表现糖耗增加,推断可能与核心多糖结构差异引起的胞内糖代谢变化有关。(4)核心多糖结构变化会影响菌膜形成,自凝集等细胞间的相互作用。通过对不同培养条件下大肠杆菌菌膜形成能力的测定,确定了溶氧和培养时间对大肠杆菌W3110菌膜形成能力的影响。通过各菌株菌膜形成的定性观察和定量测定,结果表明,核心多糖结构缺失会引起菌株菌膜形成能力的减弱,且与核心多糖的糖链结构有关。对细菌自凝集特性研究表明,大肠杆菌自凝集与环境温度无关,与细菌浓度表现正相关性,通过对细胞表面蛋白Ag43的过量表达及转录水平分析,发现大肠杆菌自凝集与细胞表面蛋白Ag43的合成有关,且核心多糖结构的变化会促进该蛋白基因的转录表达。通过测定突变菌株细胞疏水性,发现核心多糖的结构变化对细胞表面疏水性具有增强作用,且这种增强作用与糖链的长度有关。核心多糖糖链越短,疏水性越强。内核心多糖上的磷酸基团缺失对细胞表面疏水性增强效果明显。通过对W3110群体效应信号分子Lux S的转录分析,了解了核心多糖结构变化不会对该信号分子的合成产生影响,同时,也认识到鞭毛作为菌膜形成的关键因素,与细胞表面疏水性及细胞表面蛋白等一起影响着菌膜和自凝集等细胞间的相互作用。(5)通过转录组学分析,证实大肠杆菌脂多糖分子核心多糖结构变化会影响细菌鞭毛的合成组装。对大肠杆菌野生型W3110、突变菌株ΔwaaC、ΔwaaF、ΔwaaG、ΔwaaO、ΔwaaR和ΔwaaU进行了转录组测序分析。通过对ΔwaaC中表达差异显著的1382个基因、ΔwaaF表达差异显著的526个基因、ΔwaaG表达差异显著的965个基因、ΔwaaO表达差异显著的1979个基因、ΔwaaR表达差异显著的2005个基因和ΔwaaU中表达差异显著的1847个基因进行聚类分析,明确了核心多糖结构在细菌鞭毛合成及细菌趋化性中的重要作用,确定了σ28转录因子和鞭毛马达蛋白FliGM及MotAB对核心多糖结构变异的响应下调特性,并初步推断σE因子在细菌合成不同核心多糖结构情况下,通过与σ28因子及FliGM蛋白互作,对鞭毛的合成进行调控。


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1 王洲;大肠杆菌脂多糖分子的核心多糖结构变化对细胞膜及胞内代谢的影响[D];江南大学;2016年
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