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基于乳清分离蛋白修饰的低环境敏感型纳米颗粒构建与稳定机制

戴清源  
【摘要】:食品原料中含有许多具有重要生理活性的物质,在食品加工、贮藏和运输过程中,由于光、氧、热等环境因素的影响而丧失活性,或由于水溶性差导致其生物利用率低。纳米载体包埋,不但能显著增加这些生理活性成分的表观溶解度,提高其生物利用率,而且能显著降低其对环境的敏感性。蛋白质和多糖因具有良好的生物相容性、生物降解性、可再生性和无毒性等特点,常被用作生理活性成分的包埋壁材。但目前蛋白质-多糖纳米颗粒的耐p H、耐盐和耐热性等低环境敏感性问题仍未解决,限制了其在食品工业中的广泛应用。本论文首先探讨硫酸软骨素静电作用修饰与葡聚糖共价接枝修饰对乳清分离蛋白纳米颗粒稳定性的影响,阐明耐pH和耐盐型蛋白基纳米颗粒的形成与稳定机制。然后在此机制指导下利用乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物与玉米醇溶蛋白自组装形成具有良好耐pH、耐盐和耐热稳定性的低环境敏感型纳米颗粒。研究结果为制备满足食品工业需求的稳定纳米颗粒提供有益的理论指导。主要研究内容及结果如下:通过浊度法和动态光散射光法(DLS)首先分析中性多糖和离子多糖对热凝胶法乳清分离蛋白纳米颗粒耐pH和耐盐稳定性的影响,发现中性多糖葡聚糖并不能显著提高乳清分离蛋白纳米颗粒的稳定性,而离子多糖硫酸软骨素对乳清分离蛋白纳米颗粒稳定性仅具有一定的改善作用。然后制备乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物,分析热凝胶法乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/硫酸软骨素纳米颗粒的耐pH和耐盐稳定性,结果显示乳清分离蛋白共价接枝葡聚糖后其氨基基团含量下降以及傅立叶变换红外(FTIR)光谱的酰胺I-III区强度降低。乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物(9.7%接枝度)/硫酸软骨素纳米颗粒在pH 1.0-8.0范围和0.2 mol/L NaCl条件下,表现出良好的耐pH和耐盐稳定性,该纳米颗粒粒径约为150 nm,PDI约为0.08。利用DLS、透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)和扫描电子显微镜(SEM)分析叶黄素载入对乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/硫酸软骨素纳米颗粒的影响,发现叶黄素的包埋并未引起纳米颗粒粒径大小和形貌的显著变化,TEM、AFM和SEM结果显示纳米颗粒为均一分散、表面光滑的球形颗粒,其粒径分布在50-100 nm之间。DLS法与三种显微镜法所测粒径差异,表明纳米颗粒内部含有大量的水,为芯材包埋提供了充足的空间位置。采用可见光光度法和溶剂萃取法分析乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/硫酸软骨素纳米颗粒对叶黄素的包埋能力,结果显示该纳米颗粒对叶黄素具有良好的包埋能力,其载量和包封率分别为8.03%和94.07%。采用荧光光谱分析糖基化、离子多糖和热处理对蛋白质荧光基团周围微环境极性和疏水性的影响,发现共价接枝的葡聚糖和静电作用的硫酸软骨素参与到热凝胶法乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/硫酸软骨素纳米颗粒的形成过程。通过对乳清分离蛋白、葡聚糖、乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物和硫酸软骨素不同组合制备的纳米颗粒溶液体系的Zeta电位和DLS粒度分析,发现静电作用的硫酸软骨素和共价接枝的葡聚糖两者协同的空间位阻效应是形成与维持乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/硫酸软骨素纳米颗粒耐pH和耐盐稳定性的主要作用力。利用氯化钠、尿素和二硫苏糖醇等凝胶破坏剂,分析乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/硫酸软骨素纳米颗粒形成与维持其稳定性的主要作用力种类,发现静电相互作用主要促进纳米颗粒的形成,疏水相互作用是形成与维持纳米颗粒稳定性的主要作用力,氢键相互作用仅轻微影响纳米颗粒的形成与稳定,二硫键对维持纳米颗粒稳定性具有一定程度的作用。空间位阻效应和疏水相互作用是形成与稳定耐pH和耐盐型乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/硫酸软骨素纳米颗粒的关键因素。研究了一种耐pH、耐盐和耐热型自组装纳米颗粒的制备方法。利用DLS粒度和Zeta电位分析糖基化和疏水蛋白比例对乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/玉米醇溶蛋白纳米颗粒稳定性的影响,发现接枝物中葡聚糖链的空间位阻效应显著抑制了乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/玉米醇溶蛋白纳米颗粒间的聚集,而玉米醇溶蛋白的强疏水相互作用对纳米颗粒起到天然固化作用,显著抑制了纳米颗粒的解聚。无需热诱导处理,玉米醇溶蛋白的强疏水相互作用是促发乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物与玉米醇溶蛋白自组装行为的主要作用力,为热敏性芯材的包埋提供了良好的自组装壁材。乳清分离蛋白与玉米醇溶蛋白质量比为2:1,乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/玉米醇溶蛋白自组装纳米颗粒粒径约为170nm,PDI约为0.14,在pH 1-11.0、0.2 mol/L NaCl以及30-90℃条件下表现出良好的耐pH、耐盐和耐热稳定性。而当蛋白质质量比为1:1时,乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/玉米醇溶蛋白纳米颗粒粒径约为490 nm,PDI约为0.15。因此可通过调整疏水蛋白质量比,实现蛋白基纳米颗粒粒径的可控制备。优化确立了一种快速、灵敏、可靠的拉曼光谱检测方法,主要特点是利用了咖啡环效应的预浓缩作用、并采用激光共聚焦显微镜甄别出临界干燥状态。该法仅需要1μL低浓度玉米醇溶蛋白溶液或乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物溶液,1 min内即可获得其高信噪比的拉曼光谱。通过对不同稳定性蛋白基纳米颗粒拉曼光谱酰胺I区的基线校正、归一化、曲线拟合、波段匹配以及峰面积计算等光谱解析方法,获得蛋白质二级结构变化趋势,结果发现乳清分离蛋白-葡聚糖接枝物/玉米醇溶蛋白纳米颗粒的耐pH和耐盐稳定性与蛋白质二级结构的稳定性成正相关。


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