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组成型重组恶臭假单胞菌腈水解酶表达体系的构建及其发酵工艺优化

张强  
【摘要】:腈水解酶能将腈类化合物中的腈基转化为羧基从而制备获得有机酸和氨基酸等化合物,在合成医药中间体、食品添加剂及大宗化学品等领域具有广阔的应用前景。利用腈水解酶催化3-氰基吡啶合成维生素烟酸是近年来备受关注的新型绿色生产工艺。本研究室前期筛选获得一株高产腈水解酶的恶臭假单胞菌,但该野生菌在发酵过程中生物量较低、产酶水平提升空间有限,而传统的重组菌产腈水解酶多数需进行体外诱导,增加了工艺步骤和生产成本,因此,本论文以恶臭假单胞菌腈水解酶基因为研究对象,构建了腈水解酶的组成型重组表达体系,避免了IPTG使用所导致的生产成本增加及对菌体造成的毒害作用;同时通过高密度培养策略,提升了重组菌菌体密度和腈水解酶产量;以重组菌静息细胞为催化剂,建立了3-氰基吡啶连续转化生产烟酸的工艺路线。主要研究内容如下:(1)本论文首先以实验室前期获得的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830腈水解酶基因为研究目标,构建了大肠杆菌组成型表达质粒pET-3b-NIT和枯草芽孢杆菌表达质粒pMA5-NIT,分别转化至相应宿主细胞,成功构建了两种无需体外诱导的腈水解酶组成型表达系统。大肠杆菌重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-3b-NIT)在LB培养基中发酵培养8 h可达到最高酶活,为25.18 U·mL~(-1);枯草芽孢杆菌重组菌株B.subtilis WB600(pMA5-NIT)培养9.5 h可获得最高酶活,为4.55 U·mL~(-1)。鉴于大肠杆菌重组表达体系在产酶量、酶活、发酵周期以及易于进行高密度培养等方面所具备的优势,本研究最终选择大肠杆菌重组菌用于后续研究。(2)为提升E.coli BL21(DE3)(pET-3b-NIT)的菌体密度和腈水解酶产量,本研究进一步采用高密度发酵技术进行重组菌的产酶培养。通过分批发酵确立了重组菌的基本发酵条件和产酶水平,菌体最高酶活为43.98 U·mL~(-1),菌体的OD600最高为12.92;在此基础上,分别采用了恒速流加补料策略和pH-stat补料策略对重组菌进行高密度培养,在恒速流加策略下,通过连续补充菌体所需营养组分及流加氨水控制发酵液pH维持在合适范围内,重组菌最高酶活可达111.48 U·m L~(-1),菌体最大OD600为43.50;在pH-stat策略下,在补料前期,通过流加氨水维持pH稳定在6.8,pH每升高0.01开始流加补料培养基;补料中期,设置pH每升高0.03即开始流加补料培养基;补料后期则设置pH每升高0.05开始补料,得到最高酶活为653.84 U·m L~(-1),菌体最大OD600为86.40。其总酶活为目前文献报道的最高水平。(3)为研究重组菌的生物催化特性,对静息细胞的催化性质进行了考察,最适转化条件为pH 7.2、50℃,在4℃和pH 7.2条件下酶稳定性最高;最适转化底物浓度50 mM;产物烟酸浓度超过200 mM时,对酶活具有明显的抑制作用;Ag+对酶活具有强烈的抑制作用,而Li+、Ni2+、Sr2+、Mg2+、Sn2+和Co2+则对酶活具有较好的促进作用;5%和20%的1,2-丙二醇能使酶活分别提高14%和38%。为充分挖掘重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-3b-NIT)的生物转化潜力,以静息细胞为催化剂开展了3-氰基吡啶的生物转化研究。对不同的投料底物浓度研究结果表明,当采用200 mM(20.8 g·L~(-1))的底物投料浓度时,单位菌体对底物的平均转化速率最高,达到了22.90 g·h~(-1),在410 min内可完全转化17批次底物,烟酸累积浓度达到418 g·L~(-1)。对采用不同菌浓进行生物转化的实验结果表明,在较低菌浓的转化体系中,单位菌体对底物的平均转化速率相对更高,以3.51g·L~(-1)的静息细胞为催化剂时,平均转化速率高达26.97 g·h~(-1),能在290 min内完全转化22批次底物,烟酸累积浓度可达541 g·L~(-1)。转化产物中无烟酰胺副产物生成,无底物3-氰基吡啶残留。通过考察重组菌对3-氰基吡啶的连续转化反应,为工业规模的烟酸生物合成提供了理论依据。


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