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Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用

杨森  
【摘要】:枯草芽孢杆菌由于具有强大的分泌能力、能产生抗逆芽孢和是食品级微生物的特点,被广泛应用于基础研究和应用研究。因此,为便于对枯草芽孢杆菌进行基因改造,以往的研究者开发了许多实用的基因调控表达工具。但是,随着合成生物学的快速发展,这些现有的工具已经不能满足研究者的需求。因此,本研究针对性地构建了枯草芽孢杆菌基因调控表达系统并将其应用于发酵工程研究。主要研究结果如下:(1)枯草芽孢杆菌内源不同表达时期启动子文库的构建通过分析114个枯草芽孢杆菌内源启动子的表达强度与生长时期的关系,获得了3个对数期表达启动子、31个对数中期和稳定期表达启动子、74个持续型表达启动子和3个稳定期表达启动子。分析了不同的温度条件对内源启动子表达强度的影响,鉴定出了低温抑制的启动子P_(yrxA)和P_(yknW),低温激活的启动子P_(bltD)、P_(ydaD)、P_(gerBC)和P_(ylnF)和强度不受温度影响的启动子P_(menB)、P_(gap)、P_(yoxA)、P_(thrS)和P_(ydf K)。通过对比启动子在pH 5.6、6.0、7.0、8.0和8.3五种条件下的表达强度,鉴定出了活力受到酸和碱抑制的启动子P_(srfAA)、P_(ytv I)、P_(spoVB)、P_(odhA)、P_(hbs)、P_(rapI)、P_(trxA)、P_(spo IVCA)、P_(yqfD)和P_(mmgA),以及在pH 6.0条件下表现出最高活性的启动子P_(abrB)、P_(yraD)、P_(gsiB)、P_(ywnJ)、P_(ydfK)、P_(gerBC)、P_(relA)和P_(yitG)。通过采用不同表达时期的启动子,提高了酯酶、角蛋白酶和碱性果胶酶的表达量。(2)广谱启动子与广谱质粒构建对酿酒酵母最小启动子P_(min)进行理性改造,获得了在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中均有活力的强启动子P_(bs)。并在此基础上,设计了卡那霉素和遗传霉素抗性基因表达框P_(bs)-kanR,将其作为唯一的筛选标签,应用于E.coli-B.subtilis-S.cerevisiae穿梭的载体pEBS(5.8 kb)、E.coli-B.subtilis穿梭载体pEB(4.0 kb)、E.coli-S.cerevisiae穿梭载体pES(4.2 kb)的构建。遗传稳定性分析结果表明,pEBS质粒在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中均可以稳定遗传100代。此外,通过对P_(bs)进行半理性设计和筛选,获得了三个强度不同的广谱启动子P_(bs1)、P_(bs2)和P_(bs3)。(3)枯草芽孢杆菌转录后基因表达调控系统构建基于改造Type I毒素-抗毒素系统bsrG/sr4,在枯草芽孢杆菌中构建了依赖于Sr4的MS-DOS转录后基因表达调控系统。抑制细胞分裂蛋白FtsZ和绿色荧光蛋白GFP表达的结果证实了MS-DOS基因调控系统的有效性。通过使用IPTG诱导启动子P_(groE)调控Sr4的转录,实现了对靶基因可逆调控和在8.1%至82.0%范围内的精确下调。对Sr4进行不同长度的截短,并分析突变体对靶基因GFP表达的抑制效率,证明了调控RNA Sr4的核心区域是位于其3'端的33 bp序列。同时对枯草芽孢杆菌中中性蛋白酶、碱性蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的表达进行调控,证明了MS-DOS系统可以通过单个sRNA对多个基因表达进行调控。对靶基因的内部不同区域的mRNA含量进行定量分析,推断出MS-DOS转录后调控系统的机制:Sr4和gene-opr mRNA配对形成复合物,导致了靶基因mRNA由3'端至5'端降解,并使靶基因的表达受到抑制。(4)枯草芽孢杆菌食品级表达系统构建通过对Type II毒素-抗毒素系统ydcD/ydcE进行改造,在枯草芽孢杆菌中构建了食品级的表达系统。确定了不含其它碳源条件下和含有较高浓度的优势碳源条件下,诱导剂木糖的临界使用浓度分别为2.0 g×L~(-1)和5.0 g×L~(-1)。遗传稳定性分析的结果表明,食品级表达系统在分裂100代内是遗传稳定的。与传统的抗生素维持表达系统进行对比,食品级表达系统在相同的培养条件下,产生了更多的目的产物(GFP)和生物量。(5)基于基因调控表达工具优化枯草芽孢杆菌透明质酸合成途径通过在食品级表达系统中引入Streptococcus zooepidemicus来源透明质酸合酶基因hasA,实现了透明质酸在枯草芽孢杆菌中的食品级合成,产量为0.95 g×L~(-1)。基于MS-DOS调控系统对透明质酸合成竞争途径关键基因的表达进行调控,鉴定出zwf、pfkA和galE的表达下调,能够提升透明质酸产量。对zwf、pfkA和galE表达的同时抑制,透明质酸产量提高了94.7%。基于内源生长时期启动子对HA合成途径中tuaD、gtaB和glmU的表达进行优化,透明质酸产量分别提高了49.5%、54.7%和26.8%。同时下调zwf、pfkA和galE的表达,以及过量表达tuaD、gtaB和glmU,使透明质酸的产量达到了2.65 g×L~(-1)。


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