基于金银纳米隙SERS探针检测赭曲霉毒素A及细胞凋亡监控研究

【摘要】：赭曲霉毒素A(OTA)是由赭曲霉、硫色曲霉以及纯绿青霉等霉菌产生的有毒代谢产物。由OTA残留而引发的食品安全问题一直是国内外研究者关注的重点。目前针对赭曲霉毒素A的检测方法大多需要专业的技术人员和昂贵的仪器设备,而且样品前处理过程复杂。此外,一些方法的灵敏度受环境因素影响较大,往往不能进行准确检测。近年来出现的各种新型光学探针检测方法,不仅操作简单,经济方便,在灵敏度方面也有很大的提高,是国内外学者关注的热点。此外,OTA对细胞的毒性作用也是值得研究的课题,至今为止,OTA诱导细胞凋亡的毒性作用机制尚不明确,有待进一步探究。表面增强拉曼散射(SERS)的出现为OTA的检测及其毒性作用机制的研究提供了新的思路。SERS,是利用激光共振金属纳米粒子提供的局部场强增强作用来放大拉曼信号,作为一种无侵害性、特异性强、具有基团指纹识别能力的光谱,已经广泛应用于生物传感、生物过程监控等领域。纳米隙是纳米尺度下的隙壑。由于纳米隙中的电磁场较强,因此拉曼信号也得到增强。贵金属纳米隙结构作为一个有效的拉曼基底,能有效增强拉曼信号,主要分为纳米外隙、纳米内隙和纳米间隙。本论文制备了纳米外隙、纳米内隙和纳米间隙三种类型的贵金属复合纳米材料,基于这三种材料的SERS效应对OTA的检测方法和诱导细胞凋亡过程展开了研究,主要内容包括:1.合成了一种修饰有拉曼信标分子巯基苯甲酸(4-MBA)的金银纳米哑铃结构(Au@AgND),并利用OTA适配体与其互补链连接形成Au@AgND组装体,组装体粒子与粒子之间的空隙构成纳米外隙。由于适配体与OTA的亲和性,使得Au@AgND组装体解体,Au@AgND之间的距离变大,SERS信号变弱。在最优条件下,OTA浓度的对数值与拉曼信号成反比,检测线性范围为0.01~50 ng/mL时,最低检测限(LOD)为0.007 ng/m L。所构建的方法可成功应用于实际样品(啤酒)的检测。2.合成了一种带有纳米内隙的金核金银合金壳结构(Au@AuAgNNS),将拉曼信标分子4-MBA置于纳米内隙中,使Au@AuAgNNS拉曼信号显著增强。将该拉曼效应极强的粒子通过OTA适配体及其互补链与磁性纳米颗粒(MNPs)相连形成Au@AuAgNNS-MNPs组装体。OTA与适配体具有亲和性,使得Au@AuAgNNS-MNPs组装体解体,标记有拉曼信标分子的Au@Au AgNNS因解体而游离,通过磁分离取上清,测得上清液中的拉曼强度对OTA浓度进行定量检测。在最优条件下,OTA浓度的对数值与上清液中的拉曼信号强度成正比。检测范围为0.01~50 ng/m L,LOD值为0.004ng/m L,所构建的方法可成功应用于实际样品(红酒)的检测。3.合成了一种银核金纳米星结构(Ag@AuNS),其表面带有刺状枝角。枝角与枝角之间的纳米间隙具有拉曼增强效应。Ag@AuNS被巯基聚乙二醇(m-PEG-SH)和细胞穿膜肽(TAT)修饰后形成具有生物相容性的拉曼探针,能进入活细胞中并使其拉曼信号得到增强,有利于活细胞成分的分析。OTA诱导HepG2细胞凋亡,利用拉曼光谱监测HepG2细胞在凋亡过程中成分的变化,通过对不同时间段细胞的拉曼光谱的观察,凋亡过程中的主要变化有:蛋白质的变性和DNA链的断裂。这种纳米光谱与生物学过程相结合的研究,可以为阐述OTA诱导细胞凋亡的作用机制提供依据。