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聚吡咯/丝素蛋白导电复合支架制备及其对神经再生的影响

赵亚红  
【摘要】:周围神经缺损主要依靠神经移植物桥接达到修复的目的。目前常见的人工神经移植物的修复效果与自体神经相比还有很大差距。神经再生过程中采用何种材料可以更加有效地修复周围神经缺损,使其长得更快更准,是急需解决的关键科学问题。本课题考虑到神经组织本身的结构和电生理特性,以天然蚕丝为原料,将3D打印技术与静电纺丝法相结合,制备兼具导电性和导向性为一体的聚吡咯/丝素蛋白(PPy/SF)纤维基导电型复合支架,通过支架材料的理化性能表征、体外生物活性,并将其与电刺激联合使用,研究其对神经再生的影响,探讨其作为神经移植物材料的潜力。1.导电纳米复合纤维材料的制备:通过对不同原料和结构制备的PPy/SF纤维基导电型复合支架进行稳定性和拉伸性检测,筛选出PPy/SF纤维基导电型复合支架的结构和制备原料组合。借助脱胶检测、表观粘度测定、透射电镜(TEM)、iTARAQ定量分析,分析不同脱胶处理对天然蚕丝的影响。采用3D打印制备线性结构纤维状丝素蛋白(SF)作为内芯;聚合形成聚吡咯(PPy)壳层。通过导电率实验考察聚吡咯合成过程中FeCl_3与吡咯的用量比例、反应时间、反应温度对PPy/SF纤维状导电材料的影响,得到PPy/SF纤维状导电材料最优合成条件。利用静电纺丝制备PPy/SF导电型复合支架的内层和外层,通过光学显微镜和扫描电子显微镜(SEM)研究静电纺溶液的浓度、推进速度以及转轴的转速对取向性静电纺纳米纤维形貌和尺寸的影响,筛选出最优取向性静电纺的参数。结果表明:“壳-芯”结构纤维状导电材料可以更好的保持稳定性能,增强复合支架的力学拉伸性;丝素蛋白和聚吡咯组合制备的纤维状导电材料稳定性更高,电活性维持长久。浙江来源的天然蚕丝,0.05%碳酸钠溶液脱胶处理后结构饱满,蛋白成分保持良好。以FeCl_3为氧化剂,固定FeCl_3与吡咯的用量比例为1:1,聚合温度0°C,聚合时间12 h时,PPy/SF纤维状导电材料的导电率最适合。静电纺溶液浓度10%,推速0.1 mL/h,电压20 k V,转速2000 rpm,串珠少,纤维直径较细,纤维的取向程度大幅度提高。2.导电纳米复合纤维材料的性能:通过改变3D打印气压、速度、针头、间距等参数制备不同直径和不同间距的PPy/SF纤维基导电型复合支架;采用3D打印制备SF内芯,聚合形成PPy壳层,制备PPy/SF纤维状导电材料作为对照。利用光学显微镜观察其形貌结构,比较了PPy/SF纤维基导电型复合支架和PPy/SF纤维状导电材料的物理性能和化学特性,其中包括导电性试验、稳定性检测、红外光谱分析、接触角测量和体外在PBS和酶中的降解情况。实验表明:静电纺制备的PPy/SF纤维基导电型复合支架内层具有良好取向性结构,外层由纳米纤维形成多孔结构。稳定性实验表明相对于无静电纺纳米纤维的PPy/SF纤维状导电材料10 d全部剥落,纤维基导电复合支架4 w仍保持50%形态完整性,静电纺纳米纤维的包裹可以使支架结构更稳定。导电性结果发现PPy的沉积有助于SF基质形成导电聚合物,导电率为1.82±0.21×10~(-5) S/cm到1.13±0.19×10~(-3) S/cm,随纤维直径的增加而增大。薄层的纳米纤维涂层对PPy/SF纤维状导电材料的导电性影响微乎甚微。红外光谱分析发现PPy成功地长入SF基底,其分子结构在一定程度被改变。纤维基导电型复合支架接触角小于90°显示出很好的亲水性。体外降解4 w时,总失重率达55%,表明PPy/SF纤维基导电复合支架在体外蛋白酶XIV溶液中可降解。3.纤维基导电复合膜的生物学特性:采用小鼠成纤维细胞(L929)评价不同尺寸的纤维基导电复合材料的细胞毒性。通过不同尺寸的纤维基导电复合材料与施万细胞(Schwann cells,SCs)体外共培养,采用细胞增殖/毒性试剂盒(CCK8)检测细胞活力,EDU实验测试施万细胞的增殖,扫描电镜和免疫组化观察施万细胞的形态。同时将不同尺寸的导电型复合材料与背根神经节(DRG)、背根节神经元(DRG神经元)共培养,光学显微镜观察细胞生长状态,免疫组化观察轴突生长,分析不同尺寸的导电型复合材料对神经细胞活力的影响。结果表明:PPy/SF导电型复合支架示了对L929细胞生长的良好作用,而随着支架直径增加,细胞存活率降低,但没有明显的细胞毒性。施万细胞可以附着在支架表面,胞体饱满,呈纺锤状,细胞间相互连接,并在所有复合的PPy/SF支架上增殖良好,而支架直径增大会限制细胞增殖,影响细胞活力。同时PPy/SF导电复合支架有利于DRG的粘附和生长;并且可以促进轴突的延伸和生长。结果表明PPy/SF导电复合支架与周围神经组织、细胞具有良好的生物相容性,并发现具有适合导电聚合物(a1′和b1′)的材料是生物材料应用的候选材料。4.纤维基导电复合膜联合电刺激促神经细胞生长:通过对导电型复合支架联合电刺激,采用凋亡实验筛选出施万细胞合适的电刺激参数和DRG神经元合适的电刺激参数。对导电支架联合电刺激与神经细胞共培养,以光学显微镜和免疫组化观察施万细胞的生长状态,采用细胞增殖/毒性试剂盒MTT检测细胞活力,EDU实验测试施万细胞的增殖,迁移小室观察施万细胞的迁移,RT-PCR检测神经营养因子表达。同时导电支架联合电刺激与DRG神经元共培养,以光学显微镜观察细胞生长状态,定量分析神经元细胞的线性排列和突起长度。实验表明:PPy/SF导电型复合支架联合电刺激与施万细胞共培养,电刺激4 h内不会引起明显的细胞坏死,施万细胞采取的电刺激参数为100mV/mm,作用时间4 h;与DRG神经元细胞共培养,电刺激30 min细胞结构完整,很少出现凋亡,后续实验采取的电刺激参数为5 V,10 Hz,作用时间30 min。导电支架联合电刺激不仅能够通过支架取向性结构表面诱导施万细胞的排列和延伸,还能促进施万细胞的增殖和神经营养因子NGF、BDNF基因表达。此外,这种导电材料联合电刺激模式的综合作用也极大地促进了DRG和DRG神经元细胞在高度一致的方向性上的神经突起延伸。通过静电纺技术结合3D打印,成功制备带导向性结构和导电性能的纤维基导电型复合支架;通过理化性能表征,复合支架具有稳定性好,力学性能优越,电活性维持长久等优良的性能。细胞毒性检测和生物学活性评价表明复合支架具有良好的生物相容性,与电刺激联合使用能更好的促进神经细胞生长。本课题的研究为人工神经移植物的构建提供了新的方法和思路,拓展纤维基材料的功能和应用,为组织工程研究领域的应用提供前期的研究基础,为后续的研究应用提供帮助。


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