卷枝毛霉脂肪酶及其调控脂质代谢的机制

【摘要】：产油微生物可以合成大量甘油三酯(占细胞干重20-80%,w/w)。其中丝状真菌和微藻可以合成长链多不饱和脂肪酸,这些具有生物活性的脂肪酸是重要的营养食品资源。其他产油微生物,如酵母,合成的常见脂肪酸可以转化成生物柴油,是化石能源的重要替代品。产油丝状真菌卷枝毛霉,因其高产γ-亚麻酸而备受关注。大量研究从基因组、蛋白组、代谢流分布和关键酶活性方面报道了卷枝毛霉的脂质积累机制,并证明了定位于细胞溶胶中的NADP~+依赖的苹果酸酶和磷酸戊糖途径是其脂肪酸合成NADPH的主要来源。但是,目前对于卷枝毛霉脂质分解代谢的研究,尤其是调控脂质分解代谢的脂肪酶,仍是空白。本论文通过基因注释和多种生物信息学工具系统研究了卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49中脂肪酶的基因特性;结合转录分析找出四个关键脂肪酶基因,通过基因过表达初步研究了它们的功能;通过定点突变和酶活分析研究了脂肪酶Lip6和Lip10在脂质代谢中的双重角色;还研究了卷枝毛霉在不同葡萄糖-油脂混合培养基中脂质积累和脂肪酶活性的情况。本文主要研究内容和实验结果如下:通过分析卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49的基因组注释和脂肪酶保守序列特征,初步检索到高产脂菌株WJ11中存在47个潜在的脂肪酶基因,低产脂菌株CBS 277.49基因组中存在30个,这些脂肪酶共分为4类:α/β-hydrolase_1、α/β-hydrolase_3、class_3和GDSL。卷枝毛霉WJ11中的25个脂肪酶和CBS 277.49中的16个脂肪酶,不仅拥有典型的脂肪酶活性motif序列GXSXG,而且拥有乙酰转移酶活性motif序列H-(X)_4-D。亚细胞定位、信号肽和基因转录水平分析发现,WJ11中的5个脂肪酶WJ_16、29、39、40和43与CBS 277.49中的脂肪酶116027、106404和170034具有信号肽且基因转录在整个脂质积累过程中受到抑制,表明它们是潜在的分泌型/胞外脂肪酶。通过转录分析发现,在CBS 277.49中,两个脂肪酶基因161426和115761(No.6和10)的转录水平在脂质积累过程中持续上调(上调倍数1.5),而另外两个基因143450和107413(No.19和24)的转录水平在脂质积累过程中不断下调,这四个脂肪酶可能与CBS 277.49的脂质积累密切相关。通过研究3种常见油脂,大豆油、大豆磷脂和植物甾醇酯,对卷枝毛霉WJ11和CBS277.49细胞生长、脂质积累和脂肪酶活性的影响,发现CBS 277.49在葡萄糖-大豆油混合培养基上的细胞干重最高达21.2 g/L,而WJ11生长在葡萄糖-大豆磷脂混合培养基上的最大细胞干重为18.9 g/L。CBS 277.49在葡萄糖-植物甾醇酯混合培养基上合成的脂质最多达50%(w/w),而WJ11在葡萄糖-大豆磷脂混合培养基上合成的脂质最高为65%(w/w)。卷枝毛霉更偏好吸收利用外源油脂中的棕榈酸、硬脂酸和α-亚麻酸来合成胞内的甘油三酯。大豆磷脂和植物甾醇酯比大豆油更有利于卷枝毛霉的胞内脂肪酶合成。CBS 277.49生长在含植物甾醇酯培养基上时,它分泌的脂肪酶活性最高(2200 U/g protein),而WJ11在含大豆磷脂培养基上分泌的脂肪酶活性最高(2000 U/g protein)。尽管卷枝毛霉生长在葡萄糖-油脂混合培养基上时它的脂肪酶基因的转录水平剧烈上调,但是它的胞外脂肪酶活性却一直维持在较低水平(4-210 U/g protein)。结合生物信息学和转录分析,推测脂肪酶Lip6、Lip10、Lip19和Lip24可能影响卷枝毛霉CBS 277.49的脂质积累。虽然过表达Lip6和Lip10没有显著增加脂质含量,只是轻微增加细胞干重。但是,过表达Lip6使脂质中C18:3的含量提高了17%,而过表达lip10使C18:0含量下降了16%,同时轻微增加了C18:1、C18:2和C18:3的含量。在重组菌株Mc-Lip6和Mc-Lip10中,脂肪酶基因Lip6和Lip10的转录水平虽然显著上调,但是脂质降解并没有发生。然而,过表达Lip19和Lip24使卷枝毛霉细胞干重下降了9-19%,使脂质含量下降了38-41%,而且显著改变了胞内脂质的脂肪酸组成。脂肪酶Lip6和Lip10的氨基酸序列中同时包含脂肪酶活性motif序列GXSXG和乙酰转移酶活性motif序列HXXXXD。脂肪酶Lip6和Lip10与卷枝毛霉CBS 277.49中溶血磷脂乙酰转移酶及酿酒酵母脂肪酶Tgl3p、Tgl4p和Tgl5p间同源性较低,提示脂肪酶Lip6和Lip10在卷枝毛霉脂质代谢中的功能可能与酿酒酵母脂肪酶Tgl3p、Tgl4p和Tgl5p不同。这些结果提示Lip6和Lip10在卷枝毛霉中可能主要通过发挥乙酰转移酶活性来调控甘油三酯的脂肪酸组成,而Lip19和Lip24主要通过发挥脂肪酶活性调控甘油三酯的降解。通过对Lip6和Lip10的脂肪酶活性motif序列和乙酰转移酶活性motif序列进行定点突变,构建了过表达脂肪酶Lip6和Lip10不同突变体基因的重组菌株,分析它们的脂质积累和相关酶活,发现过表达仅含有乙酰转移酶活性motif序列的Lip6和Lip10基因,能增加卷枝毛霉的细胞干重和脂质产量。但是,过表达仅含有脂肪酶活性motif序列的Lip6和Lip10基因,会造成脂质降解。通过研究纯化的脂肪酶Lip6和Lip10突变体的脂肪酶和磷脂酰二酰甘油转移酶(PDAT)活性,发现Lip6和Lip10,在体外表现出微弱的脂肪酶活性和强烈的PDAT活性,其中Lip6对磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)两种底物的偏好性强于磷脂酰胆碱(PC),而Lip10能利用更多的PS合成甘油三酯(TAG)。过表达Lip6和Lip10突变体的卷枝毛霉重组菌株的胞内PDAT活性分析与磷脂合成途径关键基因转录分析表明,Lip6和Lip10的乙酰转移酶活性使卷枝毛霉可以更多地利用PS和PE提供的酰基合成TAG。