DHA和2-DHA-单甘酯的制备纯化及调节HepG2细胞脂质代谢的比较研究

【摘要】：二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种n-3多不饱和脂肪酸,它在维护人体营养健康和预防治疗某些疾病方面发挥重要作用。目前,市场上高浓度DHA多为乙酯型,相比于乙酯型,游离型和甘油酯型DHA更易吸收。此外,即使同为甘油酯型,DHA在甘油骨架上的位置不同对其生理活性亦有重要的影响。根据甘三酯在体内的代谢特点,DHA位置分布不同的甘三酯会形成DHA和2-单甘酯型DHA(2-DHAMAG)。本论文制备了高浓度DHA和2-DHA-MAG,并对2-DHA-MAG酰基转移规律进行了研究,同时以DHA和2-DHA-MAG代表DHA位置分布不同的甘三酯的代谢产物,比较其对HepG2细胞脂质代谢的影响。主要研究内容如下:首先,以金枪鱼油水解产物脂肪酸为原料,通过低温溶剂结晶和尿素包合分别富集DHA。结果表明,以乙腈作为低温结晶溶剂,可显著缩短结晶所需时间,在脂肪酸与乙腈比为1:10(w/v)、结晶温度-60°C、结晶时间1 h的条件下,使DHA的含量从26.85%提高至56.31%,回收率为60%左右;采用尿素包合法对DHA富集时,在脂肪酸:尿素:溶剂为1:3:12(w/w/v)、包合温度-8°C、包合时间10 h的条件下,DHA含量从26.85%提高至77.21%,回收率为50%左右。而在相同条件下,可使裂殖壶菌藻油水解产物脂肪酸中DHA含量从48.20%分别提升至79.82%和83.12%。然后,通过柱直径为5 cm的制备型高效液相色谱将尿素包合后的DHA脂肪酸浓缩物进一步纯化,使DHA含量提高至95.23%,回收率为49.33%。其次,采用酶法醇解金枪鱼油和裂殖壶菌藻油制备富含DHA的2-MAG,探究脂肪酶种类、底物摩尔比、反应时间、反应温度和加酶量的影响。结果表明,在油脂与无水乙醇摩尔比为1:60、反应时间2 h、反应温度30°C、Lipozyme 435添加量为8%的条件下,金枪鱼油中2-MAG含量在22.10%~27.40%、藻油中2-MAG含量在26.50%~30.95%。经正己烷和85%乙醇-水萃取后,金枪鱼油和藻油2-MAG的含量提高至94%以上,回收率在70%左右,而DHA含量分别达到53.22%和74.76%。然后通过2-MAG与乙腈之比1:10(w/v)、-40°C下结晶10 h,使金枪鱼油2-MAG中DHA含量提高至67.63%,2-MAG含量保持在90%以上;通过分子蒸馏使金枪鱼油2-MAG中DHA含量提高至59.95%,但2-MAG含量下降至69.81%,说明在蒸馏过程中2-MAG发生了酰基转移。再次,研究了2-MAG在不同温度(25°C、40°C、50°C)和不同溶剂(正己烷、乙醇、叔丁醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷)中的酰基转移规律,结果表明,2-MAG酰基转移符合一级可逆反应模型。在无溶剂体系中,温度提高25°C,酰基转移程度增加5.6倍;不同溶剂对酰基转移影响不同,酰基转移速率常数的大小为正己烷无溶剂体系二氯甲烷乙醇≈丙酮≈乙腈叔丁醇,与所选溶剂的log P值呈正相关(40°C R=0.932、50°C R=0.939,p0.01)。酰基转移后2-MAG和1-MAG组分中脂肪酸分布结果表明,40°C下,乙醇、丙酮、乙腈和叔丁烷体系中酰基转移程度较小,DHA在2-MAG中的含量高于其在1-MAG中的含量,证明DHA酰基转移速率相对较慢;50°C相同体系中,DHA在两组分中分布差异较小,可能由于温度升高,其酰基转移速率提高。最后,探讨了DHA和2-DHA-MAG对HepG2细胞脂质代谢的影响。结果表明,浓度低于50μmol/L的DHA和2-DHA-MAG均对细胞无毒害作用,均能有效地被HepG2细胞吸收,两者对细胞中DHA含量的提高无显著性差异;相对于DHA,2-DHA-MAG更有效地降低油酸诱导的脂肪变性肝细胞中总甘油三酯和总胆固醇的含量,可使细胞内甘三酯含量多下降25.21%,胆固醇含量多下降32.64%,这是因为2-DHA-MAG更有效地促进脂肪氧化关键基因PPARα和CPT-1的表达、抑制胆固醇合成关键基因HMGCR的表达。综上所述,本论文建立了高浓度DHA的富集方法,将DHA含量提高至95.23%;建立了2-单甘酯型DHA的合成和纯化方法,制备了2-MAG含量94%以上、DHA含量为74%左右的产品,并发现温度和溶剂对其酰基转移具有重要影响。通过细胞实验证实相对于DHA,2-DHA-MAG具有更显著地降低肝细胞总甘三酯和总胆固醇水平的功效,表明sn-2位DHA能更好地调节脂质代谢,为开发新剂型DHA提供了理论支持。