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格氏乳杆菌与副格氏乳杆菌的筛选、基因组比较及安全性评价

周兴雅  
【摘要】:格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)是肠道、生殖道重要菌种之一。因其具有优良的益生特性,部分菌株已应用于食品、医药等行业,但有关格氏乳杆菌比较基因组方面的研究仍是空白。2018年通过全基因组序列分析和生物信息分析,将副格氏乳杆菌从格氏乳杆菌中划分出来,成为一个新物种,但两者在基因层面的共性与差异仍不清楚。因此,全面的解析格氏乳杆菌和副格氏乳杆菌基因组,并对两者进行基因组比较,对明确两者的异同以及优良菌株选育和开发具有重要意义。本研究从人体粪便及生殖道样品中筛选格氏乳杆菌,并对菌株基因组进行测序。通过基因组分析研究菌株进化关系区分物种,比较基因组、泛基因组了解菌株基因组组成并寻找差异基因。此外,对菌株的前噬菌体、毒力因子、耐药基因进行预测,并测定菌株对13种常见抗生素的耐药性,以此评估菌株的安全性。主要结果如下:(1)从人体粪便和生殖道样品筛选菌株并鉴定菌株物种,经乳杆特异性引物GroEL测序鉴定,选取130株“格氏乳杆菌”,对菌株进行基因组草图测序得到序列,以ANI96%为阈值,初步将“格氏乳杆菌”分为两个组,一组由105株菌组成,其ANI范围在97.89%~99.92%;而另一组由25株菌株组成,ANI值范围在93.26%~94.08%,结合同源基因及管家基因系统发育进化分析,最终确认105株为副格氏乳杆菌,25株为格氏乳杆菌。(2)为了分析格氏乳杆菌、副格氏乳杆菌各自基因组的组成与特征,对其基因组一般特征分析,副格氏乳杆菌与格氏乳杆菌基因组的大小分别为1.96 Mb、1.92 Mb,GC含量分别为34.90%、34.82%。此外,分别构建副格氏乳杆菌和格氏乳杆菌的泛基因组和核心基因组,副格氏乳杆菌具有开放型泛基因组,含7371个基因,核心基因组含1274个基因。格氏乳杆菌具有闭合的泛基因组,含3614个基因,核心基因组含1360个基因。(3)为深入比较格氏乳杆菌与副格氏乳杆菌的基因组差异,对两个物种的碳水化合物活性酶家族、细菌素、CRISPR-Cas系统相关基因进行分析。结果显示,碳水化合物活性酶家族GH42只存在于副格氏乳杆菌,含有多种细菌素操纵子是副格氏乳杆菌,格氏乳杆菌只存在一种或两种细菌素操纵子,粪便来源的格氏乳杆菌同时含有IE、IIA型CRISPR-Cas系统,副格氏乳杆菌部分菌株只存在IIA型CRISPR-Cas系统,这些差异基因可能是两个物种发生聚类的原因和副格氏乳杆菌与格氏乳杆菌种内多样性高的原因。(4)对副格氏乳杆菌与格氏乳杆菌进行安全性评估,从基因层面评价包括前噬菌体、毒力因子以及耐药基因分析。结果显示,这些基因不以种属显著差异。所有菌株中在76株菌中鉴定到完整前噬菌体序列,所有菌株都检测到44个耐药基因,21个毒力因子相关基因参与粘附、抗吞噬和入侵,同时测定菌株对13种抗生素MIC发现,所有菌株对不同抗生素有不同程度的耐药。


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