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血红蛋白类酶生物传感器的研究

袁洋  
【摘要】:血红蛋白(Hb)含有卟啉环和Fe(Ⅱ)电活性中心,具有类酶活性。通过Hb的生物催化,过氧化氢(H_2O_2)、O_2、3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)可以被电化学还原。反过来,利用Hb的类酶性质可用电化学的方法来测定Hb。血红素含有Fe(Ⅱ)离子电活性中心,但深深嵌入蛋白质链中,电子转移非常缓慢,Hb在电极上的直接氧化还原非常困难。本文基于磁性分子印迹纳米粒子(MMIPs NPs)修饰磁性电极,或用壳聚糖(CS)修饰磁性电极在碱性介质中吸附Hb后,构建了用于电化学测定Hb、3-MCPD、H_2O_2的Hb类酶生物传感器。论文的主要内容如下:1.基于Hb的电化学催化还原,通过MMIPs NPs固定Hb,制备Hb类酶生物传感器电化学催化还原测定3-MCPD。采用Fe_3O_4@SiO_2 NPs为载体,Hb为模板分子,正硅酸四乙酯(TEOS)为印迹聚合物单体,表面分子印迹技术制备MMIPs NPs纳米粒子。MMIPs NPs纳米粒子具有核-壳结构,磁性Fe_3O_4纳米粒子为核,SiO_2为壳。MMIPs NPs修饰磁性电极构建了催化还原3-MCPD的生物传感器,首次实现了3-MCPD的直接电化学测定。与磁性非印迹纳米粒子(MNIPs NPs)固定Hb相比,MMIPs NPs固定Hb对3-MCPD的响应电流增加了37.5%。外加磁场使响应电流再次增加了19.6%。响应电流和3-MCPD浓度在1.0-160 mg·L~(-1)间呈线性关系,检出限为0.25 mg·L~(-1)(S/N=3)。该生物传感器已成功应用于酱油样品中3-MCPD的测定,回收率在97.4%-99.6%之间。2.将MMIPs NPs固定于壳聚糖(CS)修饰的磁性电极表面上,构建了测定H_2O_2的Hb类酶生物传感器。研究了Hb对H_2O_2的催化活性,MMIPs NPs比MNIPs NPs的响应电流增加了14.3%。在外加磁场下,MMIPs NPs、Hb和O_2的顺磁性使得该类酶生物传感器对H_2O_2的响应电流增加了60.0%。Hb类酶生物传感器响应电流与H_2O_2浓度在25-200μmol·L~(-1)间呈线性关系,检出限为3.0μmol·L~(-1)(S/N=3),表明该类酶传感器对H_2O_2具有良好的催化性能。3.将CS修饰于磁性玻碳电极(MGCE)得到的生物传感器可用于直接测定Hb。Hb吸附并固定在CS修饰MGCE上,通过Hb的类酶活性催化还原溶解氧,根据还原峰电流确定Hb的含量。碱性条件下吸附Hb,生物传感器具有较高的电化学响应,与中性条件下吸附Hb相比,响应电流增加了49.37%。此外,由于Hb和O_2的顺磁性,在外加磁场下响应电流增加了13.77%。优化了影响Hb类酶活性以及饱和溶解氧的实验参数,如吸附Hb时溶液的pH、测定时电解质的pH、温度以及离子强度等。差分脉冲伏安法(DPV)表明了还原峰电流与Hb浓度的对数之间存在线性关系。响应电流和Hb的浓度在0.05-50μg·mL~(-1)间具有线性范围,检出限为0.01μg·mL~(-1)(S/N=3)。通过DPV测定人血样中的Hb,测定结果与临床分析的参考值吻合。该生物传感器简便、快捷和灵敏。4.基于Hb对H_2O_2的电化学催化还原,将Hb富集并固定在CS修饰的磁性电极的表面上,制备了一种简便、高灵敏的测定H_2O_2的Hb类酶生物传感器。该生物传感器可以催化H_2O_2的电化学还原,实现对H_2O_2的超灵敏测定。当CS在碱性条件下吸附Hb时,生物传感器具有更高的电化学响应,几乎是中性条件下的两倍。由于Hb的顺磁性,在外加磁场下,生物传感器的响应增加了16.2%。通过紫外-可见吸收光谱研究了pH对CS吸附Hb的影响、以及外加磁场对Hb构型的影响。响应电流和H_2O_2浓度对数分别在5-250μmol·L~(-1)和0.01-1μmo·lL~(-1)范围内呈线性关系,检出限可低至0.003μmol·L~(-1)(S/N=3)。该生物传感器成功应用于牛奶样品和消毒液中H_2O_2的测定,回收率分别为96.3%-105.4%和95.3%-107.7%。


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